Plasma-Metabolom-Profilierung in zwei Kaninchenlinien, die unterschiedlich hinsichtlich des intramuskulären Fettgehalts ausgewählt wurden

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 893 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Diese Studie bietet einen gründlichen Vergleich des Plasmametaboloms zweier Kaninchenlinien, die unterschiedlich hinsichtlich des intramuskulären Fettgehalts (IMF) ausgewählt wurden. Die unterschiedliche Auswahl führte zu einer korrelierten Reaktion bei der gesamten Adipositas und machte diese Linien zu einem wertvollen Tiermaterial, um auch die Genetik von Adipositas zu untersuchen. Über 900 Metaboliten wurden nachgewiesen, und die Anpassung multivariater Modelle, sowohl diskriminant als auch linear, ermöglichte die Identifizierung von 322 mit unterschiedlichen Häufigkeiten zwischen Linien, die sich ebenfalls linear an den IMF-Gehalt anpassten. Am stärksten betroffen waren die Signalwege von Lipiden und Aminosäuren, wobei die Unterschiede zwischen den Linien zwischen 0,23 und 6,04 Standardabweichungen lagen, was auf eine begrenzte Kapazität der Linie mit niedrigem IWF zur Gewinnung von Energie aus Lipiden und einen stärkeren Katabolismus verzweigtkettiger Aminosäuren schließen lässt Die hohe IWF-Linie bezog sich auf ihren erhöhten IWF-Anteil. Darüber hinaus untermauerten Veränderungen der Metaboliten, die auf mikrobielle Aktivität zurückzuführen sind, ihre relevante Rolle bei der Lipidablagerung. Zukünftige Forschung wird sich auf die Analyse des metabolischen Profils des Blinddarminhalts und auf die Integration der verschiedenen für diese Linien verfügbaren Omics-Datensätze konzentrieren, um dabei zu helfen, die biologischen Wirts- und Mikrobiommechanismen zu entwirren, die an der IMF-Ablagerung beteiligt sind.

Der intramuskuläre Fettgehalt (IMF) ist ein Schlüsselparameter für die Fleischqualität1 und beeinflusst mehrere Eigenschaften wie Zartheit, Saftigkeit, Wasserhaltevermögen usw.2. An der Universitat Politècnica de València wurde ein divergentes Selektionsexperiment für IMF im Muskel Longissimus Thoracis et Lumborum (LTL) bei Kaninchen durchgeführt3,4. Als Ergebnis entstanden zwei Kaninchenlinien, eine mit hohem IWF-Gehalt (H) und die andere mit niedrigem IWF-Gehalt (L). Die Selektion ging von der gleichen Grundpopulation aus und beide Linien wurden gleichzeitig unter den gleichen Umweltbedingungen aufgezogen und mit der gleichen Ernährung gefüttert, was bedeutet, dass die zwischen ihnen festgestellten Unterschiede direkt auf ihre genetische Zusammensetzung zurückgeführt werden können. Diese Auswahl führte zu einer korrelierten Reaktion in der gesamten Adipositas, was diese Linien zu einem wertvollen Tiermaterial für die Untersuchung der Genetik von Adipositas machte.

In den letzten Jahren wurden mehrere Omics-Techniken eingesetzt, um eine bessere Charakterisierung der Fleischqualität zu erhalten5, wobei der Schwerpunkt auf mehreren der oben genannten Merkmale lag, darunter IMF6,7,8,9,10. Unter diesen Techniken hat die Metabolomik besondere Aufmerksamkeit erlangt und gilt als Schlüsselfaktor für Phänotypisierungsansätze der nächsten Generation11,12. Metaboliten sind organische Moleküle mit geringer Molekülmasse, die in einer biologischen Probe vorkommen. Sie sind die letzte Reaktion biologischer Systeme auf genetische und Umwelteinflüsse vor der Ausprägung des Phänotyps und werden daher als intermediärer Phänotyp betrachtet13. Die Analyse des metabolomischen Profils hat einige wertvolle Erkenntnisse über die biologischen Mechanismen geliefert, die verschiedene Qualitätsmerkmale von Fleisch und Schlachtkörpern steuern14,15,16,17. Beispielsweise war der Gehalt an Gallensäuren und Steroiden im Urin mit der Marmorierung bei Rindern verbunden, obwohl dieser Zusammenhang je nach der durchschnittlichen Tageszunahme des Tieres, dem Zeitpunkt der Probenahme und der Ernährung variierte17. Li et al.18 hingegen fanden mehrere Plasmametaboliten im Zusammenhang mit Schlachtkörperleistungsmerkmalen bei Rindern, wobei jeder einzelne nur 0,8–2,71 % der phänotypischen Varianz ausmachte, was die komplexe Natur der Merkmale widerspiegelt. Bei Schweinen waren höhere Plasmakonzentrationen verzweigtkettiger Aminosäuren19 und Serumkonzentrationen von L-Carnitin15 mit einem höheren IMF-Gehalt verbunden und wurden sogar als Biomarker vorgeschlagen. Die früheren Studien belegten die Vielfalt der Stoffwechselwege, die den IWF-Gehalt und andere Qualitätsmerkmale von Fleisch und Schlachtkörpern beeinflussen. Eine metabolomische Analyse dieser divergierenden Linien wird es uns ermöglichen, einen genaueren Blick auf die genetisch bedingten Mechanismen zu werfen, die für die Fettablagerung verantwortlich sind, und relevante Erkenntnisse zu gewinnen, die auf die Erforschung von Fettleibigkeit übertragen werden könnten.

An diesen Linien wurden bereits genomische und metagenomische Studien durchgeführt, die einerseits mehrere Gene im Zusammenhang mit dem IMF-Gehalt und seiner Fettsäurezusammensetzung20,21 und andererseits die Bedeutung der Mikrobiomaktivität für die Lipidablagerung im Muskel belegen und andere Fettgewebe22. In dieser Studie wurde ein ungezielter metabolomischer Ansatz verwendet, um die genetisch bedingten Veränderungen im Plasma-Metabolomprofil der divergenten IMF-Linien zu identifizieren und die an ihrer Differenzierung beteiligten Stoffwechselwege offenzulegen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten eine große und unterschiedliche Reaktion auf die Selektion, die sich hauptsächlich auf den Stoffwechsel von Lipiden und Aminosäuren und in geringerem Maße auf den Stoffwechsel von Kohlenhydraten und Vitamin A und E auswirkte. Im Plasma der L-Linie wurde ein allgemeiner Anstieg der Lipide beobachtet , was auf eine beeinträchtigte β-Oxidation von Fettsäuren schließen lässt. Diese Ergebnisse deuten auf eine begrenzte Fähigkeit der L-Linie hin, Energie aus Lipiden zu gewinnen, was folglich deren Aufnahme und Wiederveresterung in Muskel- und Fettgewebe verringert. Die relevantesten Ergebnisse beim Aminosäurestoffwechsel betrafen BCAA, was auf einen geringeren Abbau der H-Linie im Darm und anschließend auf einen stärkeren Katabolismus durch den Wirt hindeutete. Darüber hinaus untermauerten diese Ergebnisse die Bedeutung der Mikrobiomaktivität, indem sie mehrere aus dem Darmmikrobiomstoffwechsel stammende Metaboliten mit der Lipidablagerung in Verbindung brachten und, was noch wichtiger ist, einige der Ergebnisse bestätigten, die in der zuvor durchgeführten metagenomischen Studie gefunden wurden22.

Die Wirkung der Metaboliten auf die Entwicklung des Merkmals wurde auf der Grundlage von Funktionen abgeleitet, die aus der Literatur entnommen wurden, und auf früheren Ergebnissen, die auf diesen divergierenden Linien gefunden wurden. Es wurde keine funktionelle Validierung durchgeführt, was eine Einschränkung der vorliegenden Studie darstellen kann. Zukünftige Forschung wird sich auf die Analyse des metabolomischen Profils des Blinddarminhalts und auf die Integration der verschiedenen für diese Linien verfügbaren Omics-Datensätze konzentrieren, die dabei helfen werden, die biologischen Wirts- und Mikrobiommechanismen und ihr Zusammenspiel bei der IWF-Ablagerung zu entwirren .

Die Metabolomik hat sich als leistungsstarkes Instrument erwiesen, und die auf diesen Linien durchgeführte Analyse ergab viele Metaboliten im Zusammenhang mit der intramuskulären Fettablagerung, die es uns ermöglichten, wichtige Rückschlüsse auf die biologischen Mechanismen zu ziehen, die zu einer stärkeren oder geringeren Fettablagerung führten. In dieser Studie wurden nach der Datenverarbeitung 920 Metaboliten zur weiteren Analyse aufbewahrt (242 positiv-früh, 168 positiv-spät, 399 negativ und 111 polar), von denen 789 bekannte Entitäten waren. Die für die Alr-Transformation jedes Datensatzes ausgewählten Referenzmetaboliten gemäß der von Greenacre et al.23 beschriebenen Methodik waren: Prolin für den positiv-frühen Datensatz, Sphingomyelin (d18:2/24:1, d18:1/24:2). ) für den positiv-späten Datensatz, N-Acetylvalin für den negativen Datensatz und Glucose für den polaren Datensatz.

Die Anpassungsparameter der mit echten und permutierten Daten angepassten PLS-DA-Modelle sind in Tabelle 1 (ergänzende Daten 1 und 2) dargestellt, während die der PLS-Modelle in Abb. 1a (echte Daten; ergänzende Daten 3) und Abb. dargestellt sind . 1b (permutierte Daten; Zusatzdaten 4). Wie aus der Tabelle zur durchschnittlichen Fehlklassifizierung hervorgeht, zeigten die PLS-DA-Modelle eine gute Klassifizierungsfähigkeit von etwa 95 %, während die des Permutationstests bei etwa 50 % lag, was die Robustheit der mit dem Original angepassten PLS-DA-Modelle belegt Daten (Tabelle 1). In ähnlicher Weise zeigte der für die PLS-Modelle geschätzte Q2-Parameter eine gute Vorhersagegenauigkeit (Mittelwert: 65 %; Abb. 1a), was durch die aus dem Permutationstest erhaltene Vorhersagegenauigkeit gestützt wurde (Abb. 1b). Diese Ergebnisse zeigten, dass es eine wichtige korrelierte Reaktion auf die Selektion im Plasmametabolom der Linien gab.

Verteilung aller Q2-Werte, die aus den PLS-Modellen erhalten wurden, die während des Kreuzvalidierungsverfahrens mit (a) echten Daten und mit (b) permutierten Daten angepasst wurden.

Nachdem die PLS-DA- und PLS-Modelle entwickelt und ihre Leistung validiert worden waren, wurden die relevanten Metaboliten gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren ausgewählt. Allerdings wurden 16 der 160 PLS-Modelle, die eine schlechte Vorhersagegenauigkeit aufwiesen (Q2 < 0,4), bei der Auswahl nicht berücksichtigt (Abb. 1a). Ergänzende Daten 5 zeigen das vollständige erhaltene metabolische Profil zusammen mit einer Zusammenfassung der Ergebnisse der PLS-DA- und PLS-Modelle. In einem divergenten Selektionsexperiment werden die Linien aus derselben Grundpopulation erzeugt, mit derselben Ernährung gefüttert und gleichzeitig unter denselben Umweltbedingungen aufgezogen, was bedeutet, dass die zwischen ihnen festgestellten Unterschiede voraussichtlich hauptsächlich auf ihre genetische Zusammensetzung zurückzuführen sind . Diese Unterschiede können jedoch auch auf eine genetische Drift während des Auswahlverfahrens zurückzuführen sein. Obwohl andererseits die PLS-Analyse Metaboliten mit dem IMF-Merkmal verknüpft (unabhängig von der Linie), sind extreme Werte dieses Merkmals wahrscheinlich auf umweltbedingte Ursachen zurückzuführen. Die Berücksichtigung der Metaboliten, die sowohl im PLS-DA- als auch im PLS-Ansatz ausgewählt wurden, bestätigt daher, dass diese Unterschiede höchstwahrscheinlich auf genetische Ursachen zurückzuführen sind. Schließlich wurden 322 Metaboliten, die Unterschiede zwischen den Linien aufwiesen (ausgewählt mit PLS-DA) und linear an das IMF-Merkmal angepasst waren (ausgewählt mit PLS), als korrelierte Reaktion auf die Auswahl betrachtet (Abb. 2a).

ein Venn-Diagramm der Metaboliten, die mithilfe der PLS-DA- und PLS-Ansätze ausgewählt wurden; b Klassifizierung der 322 ausgewählten Metaboliten.

Die 322 ausgewählten Metaboliten werden zusammen mit den Stoffwechselwegen, an denen sie beteiligt sind, in den Zusatzdaten 6 aufgeführt. In Anbetracht der Anzahl der gefundenen Metaboliten waren die Stoffwechselvorgänge von Lipiden (159) und Aminosäuren (65) am stärksten betroffen. Die übrigen Metaboliten waren am Metabolismus von Xenobiotika (21), Cofaktoren und Vitaminen (14), Nukleotiden (10), Peptiden (9), Kohlenhydraten (6) und Energie (3) beteiligt (Abb. 2b und ergänzende Daten 6). . Schließlich gab es 33 Metaboliten, die nicht identifiziert werden konnten, und 2, bei denen es sich um teilweise charakterisierte Moleküle handelte. Diese große und vielfältige Reaktion auf die Selektion im Plasmametabolom stimmt mit der großen polygenen Komponente überein, die in einer zuvor an diesen Linien durchgeführten genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) gefunden wurde20.

Die gefundenen Lipidmetaboliten können wie in Abb. 3 dargestellt kategorisiert werden (Ergänzungsdaten 6). Die meisten dieser Metaboliten kamen im Plasma der L-Linie häufiger vor (127 von 159; siehe ergänzende Daten 6), und die relevantesten waren nicht veresterte Fettsäuren (NEFAs), einschließlich mittelkettiger, verzweigter und langkettiger Fettsäuren. Kette (LC) gesättigte, LC einfach ungesättigte und LC mehrfach ungesättigte Fettsäuren (0,51 bis 1,27 SD, P0 ≥ 0,96), Monoacylglycerine (MAGs; 0,73 bis 0,94 SD, P0 ≥ 0,99), Diacylglycerine (DAGs; 0,84 bis 6,04 SD, P0 = 1), Acylcarnitine (0,29 bis 1,56 SD, P0 ≥ 0,84), Acylglycine (0,41 bis 1,50 SD, P0 ≥ 0,92) und Dicarbonsäuren (0,27 bis 1,44 SD, P0 ≥ 0,83). Weitere Veränderungen im Lipidstoffwechsel spiegelten sich in der größeren Häufigkeit von Cholesterin (1,11 SD, P0 = 1), Cholesterinsulfat (0,89 SD, P0 = 1) und sekundären Gallensäuren (0,61 bis 1,01 SD, P0 ≥ 0,98) in der L-Linie wider ), Sphingomyeline (0,73 bis 1,62 SD, P0 ≥ 0,91) und Plasmalogene (0,44 bis 1,28 SD, P0 ≥ 0,94) und die geringere Häufigkeit von Lysophospholipiden (0,74 bis 1,53 SD, P0 ≥ 0,99). Die Unterschiede bei Cholesterin und Gallensäuren wurden auch im Plasma der L-Linie in der 10. Selektionsgeneration beobachtet24. Darüber hinaus fanden frühere Experimente auch größere Mengen an Triglyceriden im Plasma der L-Linie24,25.

Anzahl der unterschiedlich häufig vorkommenden Metaboliten, die für jeden Lipid-Unterweg gefunden werden.

Gallensäuren sind polare Derivate des Cholesterins und spielen eine wesentliche Rolle bei der Lipidverdauung und -absorption im Darm26. Die zuvor beobachtete größere Menge an Cholesterin und Triglyceriden kann mit der größeren Menge an Gallensäuren in Zusammenhang gebracht werden, obwohl weitere Analysen erforderlich sind, um diese Theorie zu bestätigen. Trotz dieser größeren Menge an Cholesterin und Triglyceriden können die bei allen oben genannten Lipidmetaboliten gefundenen Unterschiede darauf hindeuten, dass die Fähigkeit der L-Linie, Energie aus diesen Lipiden zu gewinnen, begrenzt ist, was zu ihrer Akkumulation zusammen mit der ihrer katabolen Produkte führt Später besprochen. Die in diesem Experiment gefundenen NEFAs und MAGs sind Produkte der Aktivität der Lipoproteinlipase (LPL) auf die Triglyceride27. Bei Schweinen mit geringerem IMF-Gehalt wurden auch stärker zirkulierende NEFAs gefunden, was auf die CC- und CT-Genotypen des LEPR-Gens zurückzuführen ist; Der Unterschied wurde jedoch einer stärkeren Fettmobilisierung bei diesen Schweinen zugeschrieben28. Andere Produkte der Hydrolyse von Triglyceriden, wie Glycerin und Glycerin-3-phosphat, waren ebenfalls für die Unterscheidung relevant, wobei die Wahrscheinlichkeit, dass sie in der L-Linie häufiger vorkommen, bei 96 % (Glycerin) bzw. 98 % (Glycerin-3-phosphat) liegt (Ergänzungsdaten 6). Auch wenn diese Metaboliten in beiden Modellen die 80 %-Schwelle nicht überschritten haben (ergänzende Daten 5), legen die statistischen Belege zusammen mit ihrer engen Beziehung zu NEFAs und MAGs nahe, dass sie auch in der Diskussion berücksichtigt werden sollten.

Die aus der Hydrolyse der Triglyceride gewonnenen Fettsäuren würden dann von den Zellen aufgenommen, wo sie durch β-Oxidation zur Energiegewinnung oxidiert oder zur Speicherung erneut verestert würden29. Die β-Oxidation von Fettsäuren findet in den Mitochondrien statt, wo langkettige Fettsäuren nicht passiv durch die Plasmamembran transportiert werden können und an Carnitin gebunden werden müssen, um Acylcarnitine zu bilden, um durch den Carnitin-Shuttle transportiert zu werden29. In diesem Experiment waren 14 der 16 gefundenen Acylcarnitine in der L-Linie häufiger anzutreffen. Die einzigen Ausnahmen waren die kurzen Acylcarnitine Butyrylcarnitin (0,82 SD, P0 = 1) und Propionylcarnitin (0,74 SD, P0 = 0,99), die ebenfalls mit dem Metabolismus verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) zusammenhängen und später besprochen werden. Darüber hinaus war Carnitin im Plasma der H-Linie häufiger vorhanden (0,74 SD, P0 = 0,99), was bereits als Biomarker für eine höhere Fleischqualität und einen höheren IMF-Gehalt bei Schweinen vorgeschlagen wurde15. Die Acylcarnitine können im Plasma ansteigen, um die Ansammlung toxischer Acyl-COAs in den Mitochondrien zu verhindern, die durch Störungen der β-Oxidation verursacht werden. Dieser Entgiftungsmechanismus, der bei Personen mit Typ-2-Diabetes und Insulinresistenz beobachtet wurde, besteht im Rückfluss der Acylcarnitine in den Blutkreislauf, was zu einem erhöhten Spiegel an Plasma-Acylcarnitinen und einem verringerten Spiegel an freiem Carnitin führt30, wie bei diesen beobachtet Linien. Die Acylglycine, bei denen es sich um Nebenmetaboliten von Fettsäuren handelt, werden auch gebildet, um die Ansammlung von toxischem Acyl-CoA zu verhindern. Beim Menschen wurde dieser Entgiftungsmechanismus bei Personen mit Störungen der Oxidation kurz- und mittelkettiger Fettsäuren beobachtet31. Weitere Ergebnisse, die diese Theorie stützen, sind die größere Häufigkeit von Dicarbonsäuren und DAGs. Die Dicarbonsäuren entstehen durch die ω-Oxidation von Monocarbonsäuren, wenn die β-Oxidation von NEFA beeinträchtigt ist32, während die erhöhte Synthese von DAGs beobachtet wurde, wenn die Aufnahme und Oxidation von Fettsäuren beeinträchtigt ist33. Die geringere β-Oxidation in der L-Linie kann auch durch die geringere Aktivität der β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, einem Enzym des β-Oxidationswegs, unterstützt werden, das in einem früheren Experiment im LTL-Muskel der L-Linie gefunden wurde34.

Die Akkumulation von Triglyceriden und ihren katabolen Nebenprodukten sowie die Akkumulation von Acylcarnitinen, Acylglycinen und Dicarbonsäuren sowie der niedrigere Carnitingehalt in der Plasma-L-Linie deuten auf eine verringerte Aufnahme in ihre Muskeln und andere Fettgewebe hin, gefolgt von einer geringeren, und möglicherweise beeinträchtigte β-Oxidation von Fettsäuren, was teilweise den geringeren Fettgehalt erklären könnte.

Die gefundenen Metaboliten aus dem Aminosäurestoffwechsel waren an mehreren Stoffwechselwegen beteiligt, was in Abb. 4 (Ergänzungsdaten 6) zu sehen ist. Unter diesen Stoffwechselwegen sticht der Stoffwechsel verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) hervor (Leucin, Isoleucin und Valin). Bei den BCAA handelt es sich um essentielle Aminosäuren, die zahlreiche metabolische und regulatorische Rollen spielen und mit einer erhöhten Lipolyse, aber auch einer erhöhten Lipogenese in Verbindung gebracht werden35. Seine Blutkonzentration wurde positiv mit dem IMF-Gehalt bei Schweinen19 und Rindern16 sowie mit Fettleibigkeit und Insulinresistenz beim Menschen36 in Verbindung gebracht. In diesem Experiment wurden keine Unterschiede bei Valin, Leucin und Isoleucin festgestellt, aber größere Mengen der modifizierten Aminosäuren (N-Acetylleucin, N-Lactoylleucin, N-Lactoylisoleucin und N-Lactoylvalin) wurden im Plasma gefunden der H-Linie (0,54–0,75 SD, P0 ≥ 0,96), zusammen mit mehreren Metaboliten aus ihrem Katabolismus, einschließlich der zuvor erwähnten BCAA-assoziierten Spezies Butyrylcarnitin und Propionylcarnitin (0,35–1,97 SD, P0 ≥ 0,88). Ausnahmsweise waren Isovalerylglycin und 3-Methylcrotonylglycin im Plasma der L-Linie häufiger anzutreffen; Allerdings handelt es sich bei diesen Metaboliten um Acylglycine, die, wie bereits erwähnt, auch als Nebenmetaboliten der Fettsäuren gebildet werden. Bei der an diesen Linien durchgeführten GWAS befand sich das BCAT1-Gen, das für das erste Enzym im BCAA-Katabolisierungsweg kodiert, das im Zytosol exprimiert wird, in einer der Regionen, die mit dem IMF-Gehalt assoziiert sind20. Dieses Gen wurde in einer epigenomweiten Assoziationsstudie37 auch mit Fettleibigkeit beim Menschen in Verbindung gebracht, wobei es in einem hypomethylierten Zustand gefunden wurde. Darüber hinaus zeigte eine Studie an Mäusen, dass die Störung des BCAT2-Gens, das in den Mitochondrien exprimiert wird, zu einem geringeren BCAA-Katabolismus und damit zu einem geringeren Fettgehalt führte38. Die in diesem Experiment gefundenen Ergebnisse deuten auf einen stärkeren BCAA-Katabolismus in der H-Linie hin, der teilweise den höheren IMF-Gehalt erklären könnte, wie er beim Menschen beobachtet wurde39, obwohl die Mechanismen nicht vollständig verstanden sind36.

Anzahl der unterschiedlich häufig vorkommenden Metaboliten, die für jeden Aminosäure-Unterweg gefunden wurden.

Weitere Veränderungen der Plasma-Aminosäurekonzentrationen umfassten größere Häufigkeiten in der L-Linie von Glycin (1,55 SD, P0 = 1) und Serin (1,04 SD, P0 = 1) sowie Metaboliten aus dem Kreatinstoffwechsel (0,75–1,18 SD, P0). = 1), Lysinstoffwechsel (0,75–1,14 SD, P0 = 1), der Glutamatstoffwechsel (0,37–1,37 SD, P0 ≥ 0,9), der Polyaminstoffwechsel (0,23–1,77 SD, P0 ≥ 0,8) und der Harnstoffzyklus, Arginin- und Prolinstoffwechsel (0,66–1,38 SD, P0 ≥ 0,98). Andererseits wies die H-Linie größere Plasmahäufigkeiten von Alanin (1,03 SD, P0 = 1), Aspartat (0,81 SD, P0 = 1), Asparagin (0,52 SD, P0 = 0,96) sowie Metaboliten von Methionin auf. Cystein-, S-Adenosylmethionin- (SAM) und Taurin-Metabolismus (0,54–0,75 SD, P0 ≥ 0,96). Unter diesen sticht der Argininstoffwechsel aufgrund des engen Zusammenhangs zwischen Arginin und Adipositas hervor. Eine Arginin-Supplementierung wurde bei adipösen Menschen mit Typ-2-Diabetes40, Ratten41, 42, Schweinen43 und Masthühnern44 negativ mit Adipositas in Verbindung gebracht und verzögerte nachweislich auch das Fortschreiten der Atherosklerose bei Kaninchen, die mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert wurden45. Mögliche Mechanismen wurden vorgeschlagen46, darunter die verstärkte Synthese von Zellsignalmolekülen wie den Polyaminen, die auch im Plasma der L-Linie häufiger vorkommen. Darüber hinaus zeigte die zuvor erwähnte Studie an Schweinen, dass die Arginin-Supplementierung einen Einfluss auf den mikrobiellen Stoffwechsel im Darm hatte43. Obwohl diese Linien mit der gleichen Nahrung gefüttert werden, ergab die an diesen Linien durchgeführte metagenomische Analyse eine größere Häufigkeit des arcA-Gens22, das für einen positiven Regulator des Arginin-Katabolismus kodiert47. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass trotz gleicher Argininaufnahme die Mikrobiomzusammensetzung der L-Linie zu einer erhöhten Verwertung führen könnte.

Es wurde gezeigt, dass die Darmmikrobiota einen großen Einfluss auf das Blutmetabolom hat48,49, was wiederum unabhängig von der genetischen Wirkung des Wirts ist50. In diesem Experiment wurden mehrere Metaboliten gefunden, die mit dem Stoffwechsel des Darmmikrobioms in Zusammenhang standen, und ihre Unterschiede deuten auf Veränderungen in der mikrobiellen Aktivität der Linien hin. Wie bereits erwähnt, waren die sekundären Gallensäuren, zu denen Lithocholat, Glycolithocolat und Desoxycholsäureglucuronid gehörten, im Plasma der L-Linie häufiger anzutreffen. Gallensäuren sind polare Derivate des Cholesterins und spielen eine wesentliche Rolle bei der Lipidverdauung und -absorption im Darm26. Die sekundären Gallensäuren werden von den Darmbakterien aus den primären Gallensäuren synthetisiert, was die Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen der Mikrobiota und den Gallensäuren für die Energiehomöostase unterstreicht. Eine metagenomische Analyse des Blinddarminhalts, die bei der 10. Selektionsgeneration durchgeführt wurde, bestätigte die Bedeutung der Funktionalität der Darmmikrobiota bei der IMF-Ablagerung; Es wurde jedoch kein klarer Zusammenhang zwischen mikrobiellen Genen, die an der Bildung sekundärer Gallensäuren beteiligt sind, und dem IMF-Gehalt gefunden22. Weitere Studien sind erforderlich, um die Rolle sekundärer Gallensäuren bei der Energiehomöostase dieser Linien aufzuklären.

Es wurde auch gezeigt, dass die oben diskutierten BCAA-Spiegel im Plasma von der Zusammensetzung des Mikrobioms abhängen51. In Übereinstimmung mit den Erkenntnissen von Ridaura et al.51 zeigte die an der 10. Generation durchgeführte metagenomische Analyse eine erhöhte Häufigkeit von Genen, die am BCAA-Abbau in der L-Linie beteiligt sind, was zu der in dieser Linie beobachteten verminderten zirkulierenden BCAA und dem niedrigeren IMF beiträgt Inhalt in der genannten Zeile22. Darüber hinaus hängt auch der Metabolismus der aromatischen Aminosäuren (AAA) Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin mit dem Mikrobiom-Metabolismus zusammen und wurde ebenfalls durch die Selektion beeinflusst. Größere Häufigkeiten der modifizierten Aminosäure N-Lactoylphenylalanin (0,49 SD, P0 = 0,95) und der Metaboliten aus dem Tryptophan- (0,25–0,78 SD, P0 ≥ 0,81) und Tyrosin-Metabolismus (0,56–0,71 SD, P0 ≥ 0,97) waren in der H-Linie gefunden. Zusammen mit den BCAAs können die AAA entweder vom Wirt oder von der Darmmikrobiota verstoffwechselt werden52, und es wurde gezeigt, dass sie bei Fettleibigkeit erhöht sind53. In diesem Experiment stammten die meisten Metaboliten aus dem AAA-Metabolismus direkt oder indirekt aus dem Darm, mit Ausnahme von Kynurenin, das ein Produkt des Tryptophan-Katabolismus über den Kynurenin-Weg des Wirts ist. Dieser Weg wird auch für die Biosynthese des Cofaktors NAD verwendet, und sein Vorläufer, das Nicotinamid, kam auch häufiger im Plasma der H-Linie vor (0,57 SD, P0 = 0,98). Schließlich waren auch Metaboliten aus dem Histidinstoffwechsel häufiger im Plasma der H-Linie vorhanden (0,30–0,74 SD, P0 ≥ 0,85). Unter diesen Metaboliten wurde das Imidazolpropionat gefunden, das von der Darmmikrobiota produziert wird. Das Imidazolpropionat kann die Entzündung und den Stoffwechsel des Wirts modulieren, es wurde positiv mit Fettleibigkeit und Diabetes in Verbindung gebracht54,55 und es wurde sogar als Prädiktor für die α-Diversität vorgeschlagen49.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Mikrobiomaktivität im Stoffwechsel des Wirts und ihren direkten Zusammenhang mit der Bestimmung des Merkmals. Eine metabolomische Analyse des Darminhalts dieser Linien würde einen weiteren Einblick in die Mikrobiomaktivität geben und es ermöglichen, die bisher erzielten Ergebnisse zu bestätigen.

Weitere interessante Veränderungen wurden im Stoffwechsel der Vitamine A und E festgestellt. Größere Mengen an Retinol (Vitamin A; 0,76 SD, P0 = 0,99), α-Tocopherol (Vitamin E; 0,82 SD, P0 = 1) und β/γ-Tocopherol (Vitamin E; 0,84 SD, P0 = 1) wurden gefunden das Plasma der H-Linie, zusammen mit Metaboliten aus dem Vitamin-E-Katabolismus (α-CEHC und α-CEHC-Glucuronid; 0,52 bis 0,67 SD, P0 ≥ 0,96). Eine Nahrungsergänzung mit Vitamin A hat widersprüchliche Auswirkungen auf die Entwicklung des intramuskulären Fettgewebes, indem sie die Präadipozytenhyperplasie fördert und die endgültige Reifung der Adipozyten hemmt56. Da diese Linien mit der gleichen Nahrung gefüttert werden, muss der zwischen ihnen festgestellte Unterschied auf den Stoffwechsel zurückzuführen sein, wie er bei Rindern mit unterschiedlicher Futtereffizienz beobachtet wurde57. Andererseits haben die Vitamin-E-Metaboliten eine wichtige antioxidative Aktivität und können auch als Signal- und Genregulationsmoleküle in Signalwegen im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel fungieren58. Trotz der zahlreichen Studien zu den Vitaminen A und E und da sie viele Stoffwechselreaktionen beeinflussen, ist nicht klar, wie sich ihr Stoffwechsel auf die intramuskuläre Fettablagerung dieser Linien auswirkt. Diese Ergebnisse weisen jedoch auf einen interessanten Zusammenhang hin, der weiter untersucht werden könnte.

Auch der Glykolyse- und Energiestoffwechsel wurde durch die Selektion beeinflusst. Weder im vorherigen24,25 noch in diesem Experiment wurden Unterschiede zwischen den Linien in der Plasmaglukosekonzentration festgestellt. Allerdings kommt es in größerer Häufigkeit zu Metaboliten, die am Aminozuckerstoffwechsel (0,68 bis 1,30 Standardabweichung, P0 ≥ 0,99), am Fruktose-, Mannose- und Galaktosestoffwechsel (0,54–1,77 Standardabweichung, P0 ≥ 0,97) und am Pentosestoffwechsel (0,53 Standardabweichung, P0 ≥ 0,97) beteiligt sind. P0 = 0,96) wurden im Plasma der L-Linie gefunden. Diese Ergebnisse stimmen mit einer anderen durchgeführten Studie überein, in der eine größere Menge an Laktose in der Milch der L-Linie gefunden wurde, was auf einen erhöhten Kohlenhydratstoffwechsel in der genannten Linie schließen lässt (Ergebnisse noch nicht veröffentlicht). Der Zusammenhang mit der intramuskulären Fettablagerung ist nicht ganz klar; Dennoch könnten diese Ergebnisse auf Unterschiede in der Glukoseverwertung zwischen den Linien hinweisen.

Das experimentelle Design und die in dieser Studie durchgeführte Analyse ermöglichten es uns, das genetisch bestimmte metabolische Profil der divergenten Linien zu erhalten, das in direktem Zusammenhang mit ihrem intramuskulären Fettgehalt steht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass es eine große und unterschiedliche Reaktion auf die Selektion im Plasmametabolom gab, was mit der großen polygenen Komponente übereinstimmt, die in der zuvor durchgeführten GWAS gefunden wurde.

Die am stärksten betroffenen Signalwege waren die von Lipiden und Aminosäuren. Es kam zu einem allgemeinen Anstieg der Lipide im Plasma der L-Linie, was auf eine beeinträchtigte β-Oxidation in der genannten Linie hindeutete. Diese Ergebnisse deuten auf eine begrenzte Fähigkeit der L-Linie hin, Energie aus Lipiden zu gewinnen, was folglich deren Aufnahme und Wiederveresterung im Muskel- und Fettgewebe verringert. Die relevantesten Ergebnisse beim Aminosäurestoffwechsel betrafen BCAA, was auf einen geringeren Abbau der H-Linie im Darm und anschließend auf einen stärkeren Katabolismus durch den Wirt hindeutete. Schließlich bestätigten die Veränderungen, die in den sekundären Gallensäuren, sowohl in den verzweigtkettigen als auch in den aromatischen Aminosäuren, und auch in den Metaboliten aus dem Arginin- und Histidinstoffwechsel gefunden wurden, die relevante Rolle der Mikrobiomaktivität bei der Entwicklung des Merkmals und verstärkten sie die Ergebnisse der zuvor durchgeführten metagenomischen Analyse.

Die Forschungsethikkommission genehmigte alle experimentellen Verfahren gemäß den Richtlinien 98/58/EG und 2010/63/EU des Rates (Referenznummer 2017/VSC/PEA/00212). Die für dieses Experiment verwendeten Kaninchen stammten aus zwei Linien, die unterschiedlich hinsichtlich des Gehalts an intramuskulärem Fett (IMF) im Muskel Longissimus thoracis et lumborum (LTL) ausgewählt wurden. Das vollständige Auswahlverfahren ist in Martínez-Álvaro et al.4 beschrieben. Kurz gesagt, die divergente Selektion begann mit einer Basispopulation von 13 Bullen und 83 Bullen, wobei eine Linie mit hohem IWF-Gehalt (H) und eine andere mit niedrigem IWF-Gehalt (L) entstand. Die Linien wurden zeitgleich unter den gleichen Umweltbedingungen aufgezogen und mit der gleichen Nahrung gefüttert. Die Würfe wurden im Alter von 28 Tagen entwöhnt, dann zusammen gehalten und bis zur Schlachtung ad libitum mit einem handelsüblichen Standardfutter gefüttert, das 16 % Rohprotein, 16,5 % Rohfaser und 2,4 % Fett, 7,6 % Asche, 0,8 % Kalzium enthielt. 0,6 % Phosphor, 0,26 % Natrium; und ergänzt mit Vitamin A (10.000 UI/kg), Vitamin D3 (900 UI/kg), Vitamin E (25 mg/kg), Eisen (78 mg/kg), Kobaltcarbonat (0,30 mg/kg), Mangan (20). mg/kg), Zink (50 mg/kg), Selen (0,05 mg/kg), Kaliumiodid (1,0 mg/kg), Kupfer (8 mg/kg) und Bacitracin-Zink-Antibiotikum (100 ppm). Die Fettsäurezusammensetzung der Nahrung, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Fettsäuren, betrug: 54,8 % C18:2n6, 19,7 % C18:1n9, 16,6 % C16:0, 5,7 % C18:3n3, 1,8 % C18 :0, 0,5 % C16:1 und 0,9 % Fettsäuren mit mehr als 20 Kohlenstoffatomen.

Um die Selektion durchzuführen, wurden zwei Vollgeschwister (ein Männchen und ein Weibchen) der ersten Parität jedes Rehs im Alter von 9 Wochen geschlachtet und der LTL-Muskel herausgeschnitten, zerkleinert und gefriergetrocknet. Der IMF-Gehalt wurde dann mithilfe der Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) unter Anwendung der von Zomeño et al. entwickelten Gleichungen quantifiziert. (2011)59, ausgedrückt als g IMF/100 g frische Muskeln. Die Rekruten wurden nach dem durchschnittlichen IMF-Wert ihrer Nachkommen eingestuft, und die besten 20 % der Rehen stellten ausschließlich Weibchen für die nächste Generation zur Verfügung. Jeder Vater wurde mit sechs Weibchen verpaart, die Partner wurden in eine Rangfolge gebracht und nur ein männlicher Nachkomme des bestbewerteten Partners jedes Vaters wurde für die nächste Generation ausgewählt, um Inzucht zu reduzieren.

Das Kaninchenfleisch zeichnet sich durch seinen geringen Fettgehalt aus. Der LTL-Muskel hat den niedrigsten Fettgehalt60 und wies in diesen Linien einen Mittelwert von 1,06 g IMF/100 g frischer Muskel auf. Die durchgeführte divergente Selektion war erfolgreich und ergab einen Unterschied in der 9. Generation von 0,45 g IMF/100 g frischem Muskel, was 3,1 Standardabweichungen des Merkmals20 entspricht.

Das Plasmametabolom wurde bei 24 Kaninchen der H-Linie (12 Männchen und 12 Weibchen) und 24 Kaninchen der L-Linie (12 Männchen und 12 Weibchen) aus der 9. Selektionsgeneration quantifiziert (siehe ergänzende Daten 7). Die Tiere wurden im Alter von 9 Wochen nach 4-stündigem Fasten geschlachtet und Blutproben aus der Halsvene wurden in Röhrchen mit K2 EDTA als Antikoagulans (Deltalab, Rubí, Spanien) gesammelt. Die Proben wurden sofort 10 Minuten lang bei 3000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen, das schließlich bei –80 °C gelagert wurde. Die Plasmaproben wurden zur Analyse mittels UPLC-MS/MS an das Labor von Metabolon, Inc. (Morrisville, North Carolina, USA) geschickt: Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (ACQUITY UPLC System, Waters) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Q-Exactive). Orbitrap (hochauflösende/genaue Masse, Thermo Scientific), verbunden mit einer beheizten Elektrospray-Ionisationsquelle (HESI-II). Der Orbitrap-Massenanalysator arbeitete mit einer Massenauflösung von 35.000.

Die Proben wurden mit dem automatisierten MicroLab STAR®-System (Hamilton Company, Reno, Nevada, USA) vorbereitet. Die Proteine wurden mit Methanol unter kräftigem Schütteln für 2 Minuten ausgefällt (Glen Mills GenoGrinder 2000) und anschließend zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben kurz auf einen TurboVap® (Zymark) gestellt, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und schließlich über Nacht unter Stickstoff gelagert. Dann wurden vier Aliquote jedes Probenextrakts entnommen und in Lösungsmitteln rekonstituiert, die mit verschiedenen Methoden kompatibel waren: zwei separate Umkehrphasen (RP)/UPLC-MS/MS mit Elektrospray-Ionisation im positiven Ionenmodus (ESI), ein RP/UPLC-MS/MS mit Negativ-Ionen-Modus-ESI und eine hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie (HILIC)/UPLC-MS/MS mit Negativ-Ionen-Modus-ESI. Diese vier Methoden werden als positiv früh, positiv spät, negativ und polar bezeichnet.

Das erste Aliquot wurde aus einer C18-Säule (Waters UPLC BEH C18-2,1 × 100 mm, 1,7 µm) unter Verwendung von Wasser und Methanol, enthaltend 0,05 % Perfluorpentansäure und 0,1 % Ameisensäure, mit einem Gradienten eluiert. Es wurde unter sauren positiven Bedingungen analysiert und chromatographisch für hydrophilere Verbindungen optimiert (früh positiv). Das zweite Aliquot wurde mit Methanol, Acetonitril, Wasser, 0,05 % Perfluorpentansäure und 0,01 % Ameisensäure mit einem Gradienten von derselben oben genannten C18-Säule eluiert. Es wurde unter sauren positiven Bedingungen analysiert, aber chromatographisch für hydrophobere Verbindungen optimiert (positiv spät). Das dritte Aliquot wurde mit Methanol und Wasser mit 6,5 mM Ammoniumbicarbonat bei pH 8 von einer separaten C18-Säule eluiert und dann unter basischen Negativbedingungen (negativ) analysiert. Das letzte Aliquot wurde von einer HILIC-Säule (Waters UPLC BEH Amide 2,1 × 150 mm, 1,7 µm) unter Verwendung eines Gradienten bestehend aus Wasser und Acetonitril mit 10 mM Ammoniumformiat bei pH 10,8 eluiert. Abschließend wurde es durch negative Ionisation (polar) analysiert. Die MS-Analyse wechselte zwischen MS- und datenabhängigen MSn-Scans unter Verwendung dynamischer Ausschlüsse. Der Scanbereich variierte zwischen den Methoden, umfasste jedoch 70–1000 m/z.

Mehrere Arten von Kontrollen wurden zusammen mit den Versuchsproben analysiert: Eine gepoolte Matrixprobe, die durch die Entnahme eines kleinen Volumens jeder Versuchsprobe erzeugt wurde, diente als technische Replikation im gesamten Datensatz; entnommene Wasserproben dienten als Prozessrohlinge; und ein Pool von QC-Standards, die sorgfältig ausgewählt wurden, um die Messung endogener Verbindungen nicht zu beeinträchtigen, wurden in jede analysierte Probe gegeben, um die Geräteleistung zu überwachen und bei der chromatographischen Ausrichtung zu helfen.

Aus den vier Methoden wurden Rohdaten extrahiert, wodurch vier Datensätze erhalten wurden: positiv früh, positiv spät, negativ und polar. Die Peaks wurden identifiziert, eine Qualitätskontrolle durchgeführt und die Verbindungen wurden durch Vergleich mit Bibliothekseinträgen gereinigter Standards oder wiederkehrender unbekannter Einheiten identifiziert. Die Identifizierungen basierten auf drei Kriterien: Retentionsindex, genaue Massenübereinstimmung mit der Bibliothek (+/– 10 ppm) und den MS/MS-Vorwärts- und Rückwärtswerten zwischen den experimentellen Daten und authentischen Standards. Die Peaks wurden mithilfe der Fläche unter der Kurve quantifiziert. Die Informationen zu Funktion und Stoffwechselwegen jedes identifizierten Metaboliten stammen aus der Human Metabolome Database und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-Datenbank.

Mit den vier Methoden (252 positiv-früh, 181 positiv-spät, 448 negativ und 116 polar) wurden im Plasma der beiden Kaninchenlinien insgesamt 997 Verbindungen nachgewiesen, von denen 852 bekannte Entitäten waren. Die Datenverarbeitung wurde für jeden Datensatz separat durchgeführt.

Die Metaboliten, die in einer großen Anzahl von Proben unentdeckt waren (dh Intensität = 0), wurden aus den Datensätzen entfernt. Nach einigen explorativen Analysen wurden nur Metaboliten beibehalten, die in mindestens einer Zeile weniger als 10 % Nullen aufwiesen, und die verbleibenden Nullen wurden mithilfe von Random Forest imputiert61. Die Quantifizierung der Metaboliten in ungezielten Metabolomics-Studien bezieht sich auf relative Veränderungen62,63, was bedeutet, dass, wie bei Zusammensetzungsdaten, die relevanten Informationen in den Verhältnissen zwischen den Teilen enthalten sind64. Daher wurde eine additive Log-Ratio-Transformation65 (alr) angewendet, die wie folgt definiert ist:

Dabei ist xj die Häufigkeit des j-ten Metaboliten, xref die Häufigkeit eines Referenzmetaboliten und J die Gesamtzahl der Metaboliten im Datensatz. Der Referenzmetabolit wurde nach der von Greenacre et al. vorgeschlagenen Methodik ausgewählt. (2021)23. Kurz gesagt bestand diese Methodik darin, den Metaboliten auszuwählen, der (1) die Geometrie des gesamten Satzes von Log-Verhältnissen in einer Procrustes-Analyse reproduzierte (gemessen anhand der Procrustes-Korrelation) und (2) eine geringe Varianz aufwies, um sicherzustellen, dass die Hauptvariation vorhanden ist aufgrund des Zählers. Nach der Datenverarbeitung wurden die vier Datensätze, die den vier zuvor beschriebenen Methoden entsprechen, zusammengefügt und wie unten beschrieben analysiert.

Die Stoffwechselunterschiede zwischen den Linien wurden durch zwei separate Analysen identifiziert. Die erste war eine partielle Kleinste-Quadrat-Diskriminanzanalyse (PLS-DA), bei der die abhängige Variable ein kategorialer Vektor war, der die H- oder L-Linie kodierte. Die zweite Variante war eine lineare partielle Methode der kleinsten Quadrate (PLS), deren abhängige Variable ein Vektor war, der den IWF-Inhalt enthielt. Beide wurden mit dem R-Paket mdatools66 nach Standardisierung des Datensatzes durchgeführt (dh den Mittelwert subtrahieren und durch die Standardabweichung dividieren).

Eine modellübergreifende Validierung (CMV) wurde durchgeführt, um eine Überanpassung der PLS-DA- und PLS-Modelle67 zu vermeiden und die relevanten Metaboliten68 auszuwählen. Der CMV besteht aus einer inneren Kreuzvalidierung (CV), die zur Entwicklung und Optimierung der Modelle durchgeführt wird, und einem äußeren CV zum Testen der Leistung der Modelle67. Nach einigen explorativen Analysen wurden ein 7-facher innerer CV und ein 8-facher äußerer CV verwendet. Zunächst wurden die Proben in 8 Gruppen zu je 6 Proben aufgeteilt (8-facher äußerer CV) und eine Gruppe als Testsatz beiseite gelegt. Die verbleibenden Proben (Trainingssatz) wurden einem 7-fachen inneren CV-Verfahren unterzogen, um das Modell zu entwickeln und zu optimieren. Sobald das Modell entwickelt war, wurde dann ein Variablenauswahlschritt durchgeführt, bei dem der Wert der Variablenbedeutung in der Projektion (VIP) und das Konfidenzintervall ihrer Regressionskoeffizienten (CI) verwendet wurden. Es wurden nur diejenigen Metaboliten aufbewahrt, die einen VIP-Wert ≥ 0,8 hatten und deren 95 %-KI nicht die 0 enthielten. Schließlich wurde ein neues Modell mit den ausgewählten Metaboliten angepasst und es wurde verwendet, um die Linie (im Fall von PLS-DA) oder den IMF-Gehalt (im Fall von PLS) der zuvor als Testsatz reservierten Proben vorherzusagen . Dieser Vorgang wurde achtmal wiederholt, bis alle Gruppen des äußeren CV einmal beiseite gelegt waren. Zusätzlich wurden 20 CMV-Iterationen durchgeführt, wodurch sich die Zusammensetzung der genannten Gruppen änderte (Abb. 5).

Die Proben wurden in 8 Gruppen (8-facher äußerer CV) eingeteilt. Eine Gruppe von Proben wurde als Testsatz beiseite gelegt und die verbleibenden Proben (Trainingssatz) wurden einem 7-fachen inneren CV unterzogen, um das Modell zu entwickeln und zu optimieren. Nachdem das Modell entwickelt war, wurde ein Variablenauswahlschritt durchgeführt und ein endgültiges Modell angepasst. Das endgültige Modell wurde verwendet, um die Linie (im Fall von PLS-DA) oder den IWF-Gehalt (im Fall von PLS) der zuvor beiseite gelegten Probengruppe vorherzusagen. Der Vorgang wurde 8-mal wiederholt (1–8-fach), bis alle Gruppen im Testsatz waren. Das gesamte CMV-Verfahren wurde 20 Mal wiederholt, wodurch sich die Probenzusammensetzung der Test- und Trainingssätze des äußeren CV änderte.

Nach dem CMV wurden insgesamt 160 PLS-DA- und 160 PLS-Modelle angepasst, um jeden Testsatz vorherzusagen (20 Runden mit 8-fachem Außen-CV). Die aus den PLS-DA-Modellen erhaltenen Vorhersagen wurden verwendet, um eine durchschnittliche Fehlklassifizierungstabelle zu erstellen, um die Klassifizierungsfähigkeit der Modelle zu bewerten, während der Q2-Parameter zur Bewertung der Vorhersagefähigkeit der PLS-Modelle verwendet wurde. Zusätzlich wurde ein Permutationstest durchgeführt, um zu analysieren, ob die Leistung der Modelle besser war als die, die sich durch Zufall ergeben würde. Zur Durchführung des Tests wurden die Werte der abhängigen Variablen (H- und L-Klassen für PLS-DA oder IWF-Gehalt für PLS) permutiert und neue Modelle angepasst, wobei der oben erwähnte CMV-Prozess durchgeführt wurde. Die durchschnittliche Fehlklassifizierungstabelle wurde für die PLS-DA-Modelle berechnet, während der Q2-Parameter für die PLS-Modelle ermittelt wurde67.

Nachdem alle Modelle angepasst und validiert waren, wurden diejenigen Metaboliten als relevant angesehen, die in mehr als 80 % der Modelle ausgewählt wurden (dh in mehr als 128 PLS-DA- oder PLS-Modellen, unabhängig voneinander). Schließlich wurden nur die in beiden Ansätzen (PLS-DA und PLS) ausgewählten Metaboliten für die weitere Analyse berücksichtigt.

Das Vorzeichen und die Größe der Unterschiede in der Metabolitenhäufigkeit wurden als phänotypischer Unterschied zwischen den Linien geschätzt. Das angewendete lineare Modell war

Dabei ist y der Vektor der Phänotypen, b der Vektor der festen Effekte einschließlich der Linien- und Geschlechtseffekte, e der Vektor der Restvarianzen und X die Inzidenzmatrix. Die Bayes'sche Inferenz wurde mit dem Programm Rabbit (Institut für Tierwissenschaft und -technologie, UPV, Valencia, Spanien) angewendet69,70. Für alle festen Effekte und Varianzen wurden begrenzte flache Priors angenommen. Es wurde angenommen, dass die verbleibenden Zufallseffekte unkorreliert und a priori multinormalverteilt waren wie: e ~ N (0, Iσ2e).

Die marginalen hinteren Verteilungen der phänotypischen Unterschiede zwischen H- und L-Linien wurden durch Gibbs-Probenahme ermittelt. Die berücksichtigten Parameter der Posteriorverteilungen waren der Median der Differenz (DH-L), das höchste Posteriordichteintervall bei 95 % (HPD95 %) und die Wahrscheinlichkeit, dass die Differenz größer als Null ist, wenn DH-L > 0 oder kleiner als Null, wenn DH-L < 0 (P0)70. Zusätzlich wurden die Unterschiede zwischen den Linien jedes Metaboliten als Einheiten ihrer Standardabweichung (SD) ausgedrückt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Quelldaten, die Abb. 1 und Tabelle 1 zugrunde liegen, finden Sie in den Zusatzdaten 1–4. Quelldaten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 2b, 3 und 4 sind in den Zusatzdaten 6 enthalten. Weitere im Rahmen der aktuellen Studie analysierte Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation, Projektnummer PID2020-115558GB-C21, und von der Conselleria für Innovation, Universitäten, Wissenschaft und digitale Gesellschaft, Projektnummer AICO/2020/349, finanziert. Der Open-Access-Gebühr wurde von der Universitat Politècnica de València finanziert.

Institut für Tierwissenschaften und -technologie, Polytechnische Universität Valencia, Valencia, Spanien

Augustine Zubiri-Gaitan, Augustine Blasco und Pilar Hernandez

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Die Konzeptualisierung und das experimentelle Design wurden von AB und PH durchgeführt. Die Daten wurden von PH gesammelt und von AZG analysiert. Das Manuskript wurde von AZG verfasst und von PH und AB überprüft. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Agostina Zubiri-Gaitan oder Pilar Hernandez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Shaoming Fang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Luke R. Grinham und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zubiri-Gaitán, A., Blasco, A. & Hernández, P. Plasma-Metabolom-Profilierung in zwei Kaninchenlinien, die unterschiedlich hinsichtlich des intramuskulären Fettgehalts ausgewählt wurden. Commun Biol 6, 893 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05266-3

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Eingegangen: 02. März 2023

Angenommen: 21. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05266-3

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