Anaerobe Oxidation von Propan gekoppelt mit Nitratreduktion durch eine Abstammungslinie innerhalb der Klasse Symbiobacteriia

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6115 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es wird angenommen, dass anaerobe Mikroorganismen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Flusses kurzkettiger gasförmiger Alkane (SCGAs; einschließlich Ethan, Propan und Butan) aus terrestrischen und aquatischen Ökosystemen in die Atmosphäre spielen. Es wurde bestätigt, dass Sulfat als Elektronenakzeptor fungiert und die mikrobielle anaerobe Oxidation von SCGAs unterstützt. In anaeroben Umgebungen existieren jedoch mehrere andere energetisch günstigere Akzeptoren neben diesen Gasen. Hier zeigen wir, dass ein mit Biomasse aus einer Abwasseraufbereitungsanlage geimpfter Bioreaktor eine anaerobe Propanoxidation in Verbindung mit einer Nitratreduktion zu Distickstoffgas und Ammonium durchführen kann. Der Bioreaktor war mehr als 1000 Tage lang in Betrieb und wir verwendeten 13C- und 15N-Markierungsexperimente sowie metagenomische, metatranskriptomische, metaproteomische und Metabolitenanalysen, um die mikrobielle Gemeinschaft und die Stoffwechselprozesse zu charakterisieren. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass eine Spezies, die eine neue Ordnung innerhalb der Bakterienklasse Symbiobacteriia darstellt, für die beobachtete Nitrat-abhängige Propanoxidation verantwortlich ist. Das geschlossene Genom dieses Organismus, den wir als „Candidatus Alkanivorans nitratireducens“ bezeichnen, kodiert Wege für die Oxidation von Propan zu CO2 durch Fumarataddition und für die Nitratreduktion, wobei alle Schlüsselgene während der nitratabhängigen Propanoxidation exprimiert werden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Nitrat eine relevante Elektronensenke für die SCGA-Oxidation in anaeroben Umgebungen ist und eine neue mikrobiell vermittelte Verbindung zwischen den Kohlenstoff- und Stickstoffkreisläufen darstellt.

Eine beträchtliche Menge Erdgas wird aus Tiefseesedimenten und Kohlenwasserstoffsickern an Kontinentalrändern und terrestrischen Ökosystemen erzeugt1,2. Der größte Teil des freigesetzten Erdgases wird von Mikroorganismen in anoxischen Zonen verbraucht, bevor das Gas in oxische Umgebungen und die Atmosphäre diffundiert3,4,5. Studien zur anaeroben Oxidation von Erdgas haben sich auf das starke Treibhausgas Methan als am häufigsten vorkommenden Bestandteil (~60–90 %) konzentriert6,7. Allerdings sind auch kurzkettige gasförmige Alkane (SCGAs), darunter Ethan, Propan, n-Butan und Isobutan, wesentliche Bestandteile von Erdgas (bis zu ~20 %)8 und wichtige Vorläufer von Ozon und organischen Aerosolen9. Die globalen atmosphärischen Emissionen von SCGAs werden auf 9,2–9,6 Tg pro Jahr für Ethan, 9,6–10,5 Tg pro Jahr für Propan, 10 Tg pro Jahr für Butan und 4,2 Tg pro Jahr für Isobutan geschätzt10.

Die anaerobe Oxidation von Methan (AOM) wurde ausführlich untersucht und ist relativ gut verstanden7,11,12,13,14,15,16,17. Anaerobe methanotrophe Archaeen (ANME) oxidieren Methan über den umgekehrten Methanogeneseweg, einschließlich des Schlüsselkomplexes Methyl-CoM-Reduktase (MCR). Die ANME transportieren Elektronen von Methan zu syntrophischen sulfatreduzierenden Bakterien (SRB)11,12 oder direkt zur Reduktion von Nitrat und Metalloxiden13,14,15,16. Das Bakterium „Candidatus Methylomirabilis oxyfera“ führt AOM über den „intra-aeroben“ Methanoxidationsweg durch, wobei Nitrit als einziger Elektronenakzeptor verwendet wird17. Mikroorganismen koppeln wahrscheinlich auch die Oxidation von SCGAs an die Reduktion dieser Elektronenakzeptoren unter anoxischen Bedingungen18. 'Ca. Es wurde gezeigt, dass M. oxyfera‘ in der Lage ist, Ethan und Propan über die Methanmonooxygenase zu oxidieren, obwohl noch nicht gezeigt werden muss, ob diese Kohlenstoffquellen das Wachstum unterstützen19. Bisher wurde Sulfat als einzige Elektronensenke identifiziert, die die anaerobe Oxidation von SCGAs unterstützt20,21,22,23,24,25. Das deltaproteobakterielle Isolat Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxidiert Propan und Butan über den Fumarat-Additionsweg und erzeugt Alkyl-substituierte Succinate, ein Prozess, der durch Alkylsuccinat-Synthase (ASS)20,21 vermittelt wird, und reduziert Sulfat direkt zu Sulfid. Es wurde festgestellt, dass eine Anreicherung des Archaeons „Candidatus Syntrophoarchaeum“ Butan über die Bildung von Butyl-Coenzym M aktiviert, ein Prozess, der durch eine divergente MCR katalysiert wird, wobei Reduktionsäquivalente zu syntrophischen SRB-Partnern geleitet werden23. In ähnlicher Weise wurde die anaerobe Ethanoxidation mit dem verwandten „Candidatus Argoarchaeum ethanivorans“ in Verbindung gebracht, der ebenfalls einen MCR-ähnlichen Komplex kodierte und vermutlich eine syntrophische Beziehung mit SRB22 eingeht. Es muss jedoch noch ein Archäon identifiziert werden, das in der Lage ist, die anaerobe Propanoxidation direkt gekoppelt mit der Sulfatreduktion zu vermitteln.

Nitrat ist wie Sulfat ein häufiger Elektronenakzeptor in natürlichen Ökosystemen26 und wird vom ANME-Archaeon „Ca“ verwendet. Methanoperedens nitroreducens‘ für AOM13. Die mit der Oxidation von SCGAs gekoppelte Nitratreduktion (Gleichung (1) am Beispiel von Propan) ist auch thermodynamisch besser durchführbar als die Reaktionen der SCGA-Oxidation gekoppelt mit der Sulfatreduktion (△Go'= −102 kJ/mol Propan)20 , kann aber noch nicht mit einer mikrobiellen Abstammungslinie in Verbindung gebracht werden.

Hier haben wir Massen- und Elektronenbilanztests, 13C- und 15N-Markierungsexperimente, 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung, Metabolitenanalysen und Multi-Omics-Ansätze kombiniert, um den Nachweis zu erbringen, dass eine neue Bakterienart innerhalb der Klasse Symbiobacteriia eine anaerobe Oxidation von Propan gekoppelt an Nitrat durchführt die Ermäßigung.

In dieser Studie wurde ein anaerober Bioreaktor, der mit Biomasse aus einer Abwasseraufbereitungsanlage beladen war, mehr als 1000 Tage lang pulsierend mit Propan und Nitrat gespeist. Langzeitleistungsdaten zeigten den gleichzeitigen Verbrauch von Propan und Nitrat mit einer Anreicherung von Ammonium- und Distickstoffgas und einer vorübergehenden Anreicherung von Nitrit (ergänzende Abbildung 1). In den Kontrollinkubationen (ohne Zugabe von Anreicherungskulturbiomasse oder Propan, ergänzende Abbildung 2) wurde kein Nitratverbrauch beobachtet, was darauf hindeutet, dass die mit dem Propanverbrauch im Bioreaktor gekoppelte Nitratreduktion (zu Nitrit, Ammonium und N2) mikrobiell vermittelt wurde. Um die Nitrat-abhängige anaerobe Propan-Oxidationsreaktion zu bestätigen und die Endprodukte davon zu verifizieren, wurde Biomasse aus dem Elternreaktor in Batch-Experimenten mit 13C-markiertem Propan (13CH313CH213CH3) und 15N-markiertem Nitrat (15NO3−) inkubiert, die zu etwa 8 % hinzugefügt wurden. und ~1 % des gesamten Propans bzw. des gesamten Nitrats. Die Menge an Gesamt-CO2 und 13C-markiertem CO2 nahm zu, begleitet von einer Abnahme von C3H8 und 13C3H8 (Abb. 1a, b). Das Verhältnis (2,42) zwischen dem insgesamt erzeugten 13CO2 (46 μmol) und dem gesamten verbrauchten 13C3H8 (19 μmol) lag nahe am theoretischen stöchiometrischen Verhältnis von 3:1. Die Kohlenstoffbilanz lässt darauf schließen, dass Propan mit CO2 als Endprodukt oxidiert wurde. Der gesamte NO3−-Verbrauch (0,73 mmol) stimmte mit der kombinierten gesamten N2- und NH4+-Produktion (0,8 mmol) überein (Abb. 1c). In ähnlicher Weise lag der 15NO3−-Verbrauch (9,38 μmol) nahe am 15N in 29N2 (1,1–1,5 % des gesamten N2), 30N2 (0,03 % des gesamten N2) und 15NH4+, die zusammen 9,71 μmol betrugen (Abb. 1d). Diese Ergebnisse bestätigten die Reduktion von Nitrat zu Distickstoffgas und Ammonium. Die bei der anaeroben Oxidation von Propan (AOP, 5,03 mmol) erzeugten Elektronen lagen nahe am Elektronenbedarf für die NO3−-Reduktion zu N2 und NH4+ (5,15 mmol), was darauf hindeutet, dass die durch AOP erzeugten Elektronen für die Denitrifikation und dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammoniak (DNRA) verwendet wurden ), was mit den folgenden Reaktionen übereinstimmt27:

a Umwandlung von C3H8 zu CO2, b 13C3H8 zu 13CO2, c NO3− zu NH4+ und N2 mit vorübergehender Bildung von NO2−, d 15NO3− zu 15NH4+ und 29N2 mit vorübergehender Bildung von 15NO2−. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Stöchiometrische Experimente wurden sowohl im Stammreaktor als auch in Batch-Inkubationen durchgeführt, die mit Biomasse aus dem Stammsystem geimpft wurden, um die Stickstoff- und Elektronenbilanz genauer zu bestimmen. Die Nitrat-/Nitritreduktion schien in zwei unterschiedlichen Stufen zu erfolgen (Abb. 2a). In Stufe 1 (vor dem Nitratabbau) wurde Nitrat in Nitrit- und Distickstoffgas umgewandelt, wobei die Ammoniumproduktion vernachlässigbar gering war. In Stufe 2 (nach dem Nitratabbau) wurden sowohl Distickstoffgas als auch Ammonium aus dem in Stufe 1 angesammelten Nitrit erzeugt. Die Beobachtung, dass DNRA überwiegend dann auftrat, wenn Nitrat limitierend wurde, steht im Einklang mit früheren Studien28,29,30. Das Verhältnis zwischen Nitratverbrauch zu Distickstoffgas und Ammoniumproduktion in dreifachen Chargentests (Abb. 2a, ergänzende Abb. 3) betrug 1,03 ± 0,05 (Abb. 2b, ergänzende Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass Nitrat schließlich vollständig in Distickstoffgas umgewandelt wurde ( 57,3 ± 5,5 %) und Ammonium (42,7 ± 5,5 %). Das Verhältnis zwischen Elektronenproduktion (berechnet aus Propanoxidation zu CO2) und Elektronenverbrauch (Nitratreduktion) betrug 1,10 ± 0,01 (Abb. 2b, Ergänzungstabelle 1), was darauf hindeutet, dass die Nitratreduktion die primäre Elektronensenke für die Propanoxidation war.

a Typisches biochemisches Profil der Systeme (begonnen am Tag 1050), das einen gleichzeitigen Nitrat- und Propanverbrauch mit vorübergehender Bildung von Nitrit und der Produktion von Distickstoffgas und Ammonium zeigt. Die Nitratreduktion schien in zwei unterschiedlichen Phasen zu erfolgen. In Stufe 1 wurde Nitrat mit vernachlässigbarer Ammoniumproduktion in Nitrit- und Distickstoffgas umgewandelt; während in Stufe 2 sowohl Distickstoffgas als auch Ammonium aus angesammeltem Nitrit erzeugt wurden. b Die durchschnittlichen Stickstoff- und Elektronenbilanzen wurden aus den drei Chargentests berechnet (vollständige Daten und Berechnungen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1). Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Community-Profiling mit 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung ergab, dass ein bakterieller Phylotyp, der zu einer nicht klassifizierten Linie innerhalb des Stammes Firmicutes gehört, die am häufigsten vorkommende Population im Bioreaktor war (20,1 % am Tag 985, ergänzende Abbildung 4), obwohl er im Inokulum nicht nachweisbar war. Um ein repräsentatives Genom für die dominante Population zu erhalten, wurde eine lange (Nanopore) und kurze (Illumina) metagenomische Sequenzierung (Supplementary Data 1) an Biomasse aus dem Bioreaktor durchgeführt, die am Tag 1040 beprobt wurde. Die Zusammenstellung und Klassifizierung der metagenomischen Daten führte zur Wiederherstellung von 59 nahezu vollständigen Genomen (≥70 % Vollständigkeit und ≤10 % Kontamination basierend auf CheckM, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Abb. 5), einschließlich 11 vollständig zirkularisierter Genome (Ergänzende Daten 1). Die am häufigsten vorkommende Population wurde mit der Genome Taxonomy Database (GTDB) klassifiziert, um eine neue Ordnung innerhalb der Klasse Symbiobacteriia des Phylum Firmicutes darzustellen (22,8 % der relativen Häufigkeit, Ergänzungstabelle 2). Wir schlagen für dieses Bakterium aufgrund seiner Fähigkeit zum nitratabhängigen Propanabbau (siehe unten) den Namen „Candidatus Alkanivorans nitratireducens“ vor. Das 16S-rRNA-Gen (1536 bp) wurde aus dem 'Ca. Das MAG von A. nitratireducens war identisch mit der reichlich vorhandenen 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenz, die mit den Firmicutes verbunden ist. Die 'Ca. Das MAG von A. nitratireducens war vollständig und kreisförmig mit einer Größe von 2,43 Mbit/s (ergänzende Abbildung 6). Ein genombasierter phylogenetischer Baum zeigte, dass das „Ca. A. nitratireducens‘ unterschied sich phylogenetisch von öffentlich verfügbaren Symbiobacteriia (Abb. 3a). Die durchschnittliche Nukleotididentität (ANI) und Aminosäureidentität (AAI) des 'Ca. Das Genom von A. nitratireducens stützt im Vergleich mit denen seiner nächsten Verwandten in GTDB, d. A. nitratireducens' als neue Ordnung innerhalb der Klasse Symbiobacteriia31. Der 16S-rRNA-Genbaum (ergänzende Abbildung 7) zeigt auch, dass das 'Ca. A. nitratireducens ist phylogenetisch von anderen klassifizierten Symbiobacteriia entfernt (<84,1 % 16S-rRNA-Genidentität)31 und hat keine nahen Verwandten in der Silva-Datenbank. Drei FISH-Sonden (SYMB-1018, SYMB-624 und SYMB-186) wurden entworfen und einzeln auf die Bioreaktor-Biomasse angewendet, um die Morphologie und räumliche Anordnung des „Ca“ zu visualisieren. Zellen von A. nitratireducens. Die mikroskopische Untersuchung der Biomasse ergab diffuse Flocken, wobei die Zellen offenbar in einer extrazellulären, polymeren, substanzähnlichen Matrix eingebettet waren. 'Ca. A. nitratireducens erschien als eingebettete stäbchenförmige Zellen (~0,5 µm × 1,5 µm), die manchmal Aggregate bildeten (bis zu ~50 µm) und reichlich vorhanden und relativ gleichmäßig in den Flocken verteilt waren (Abb. 3b und ergänzende Abb. 8). Die Morphologie und räumliche Anordnung der Zellen war für alle drei Sonden konsistent, was Vertrauen in ihre Spezifität gab (ergänzende Abbildung 8).

ein genombasierter phylogenetischer Baum. Die 'Ca. Das Genom von A. nitratireducens aus dieser Studie ist in roter Schrift hervorgehoben. Schwarze und weiße Punkte stehen für Bootstrap-Werte von >90 % bzw. >70 %. Die Maßstabsbalken zeigen Aminosäuresubstitutionen pro Stelle an. b Eine zusammengesetzte Fluoreszenzmikroskopaufnahme der Anreicherungskultur, hybridisiert mit der SYMB-1018-FISH-Sonde (Cy3, rot; gezielt auf „Ca. A. nitratireducens“) und gefärbt mit DAPI (blau; alle mikrobiellen Zellen). 'Ca. Die Zellen von A. nitratireducens erscheinen magenta (blau + rot). Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. Das repräsentative Bild wurde basierend auf der visuellen Beurteilung von sechs separaten Hybridisierungsexperimenten ausgewählt. Konsistente Ergebnisse wurden auch unabhängig voneinander mit zwei zusätzlichen Sonden erzielt, die auf das „Ca“ abzielten. Population von A. nitratireducens (ergänzende Abbildung 8). c, d Relative Expression jedes Genoms und nicht gruppierter Contigs sowie mikrobieller Metabolismus, der für die Genome im Bioreaktor von Interesse ist. Für jedes Gen wurde die Gesamttranskriptzahl pro Million (TPM) berechnet. Genomsätze mit einer Gesamtexpression des Gesamt-TPM > 1 % werden angezeigt (c). Die KEGG-Annotation wurde verwendet, um ORFs zu identifizieren, die für die Wege der Denitrifikation (M00529) und der dissimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium (M00530) kodieren (d). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anmerkung zum „Ca. Das MAG von A. nitratireducens identifizierte Gene für einen ASS-Komplex, einschließlich zwei AssD- (identische Aminosäuresequenzen) und drei AssA-Untereinheiten (89,3–90,7 % Ähnlichkeiten in den Aminosäuresequenzen, ergänzende Abbildung 9), die den ersten Schritt der anaeroben Aktivierung von vermitteln SCGAs durch Fumarataddition20,32. Ausrichtung von 'Ca. Die AssA-Aminosäuresequenzen von A. nitratireducens mit homologen Sequenzen in der NCBI-Datenbank bestätigten die Konservierung wichtiger Aminosäurereste (Gly828 und Cys489 in AssA1, Gly501 und Cys169 in AssA2, Gly828 und Cys489 in AssA3, ergänzende Abbildung 10). wichtig für die Funktion Fumarat-addierender Enzyme33. Phylogenetische Analysen ergaben, dass AssA und AssD von 'Ca. A. nitratireducens sind in den NCBI- und UniRef-Datenbanken phylogenetisch von Fumaratadditionsenzymen (AssAD und BssAD) entfernt (Abb. 4c; ergänzende Abb. 11). Darüber hinaus ist die 'Ca. Das MAG von A. nitratireducens enthält alle Gene, die für den weiteren Abbau von Propylsuccinat/Isopropylsuccinat erforderlich sind, einschließlich Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene (mcmA) für die Umlagerung des Kohlenstoffgerüsts, Propionyl-CoA-Carboxylase-Gene (pccB) für die Decarboxylierung und die Schlüsselgene für Beta-Oxidation34,35 (Abb. 5; Ergänzende Daten 2). Das durch Betaoxidation erzeugte Acetyl-CoA kann in den oxidativen Tricarbonsäurezyklus (TCA) zur vollständigen Oxidation zu CO2 oder zur Regenerierung von Fumarat für nachfolgende Propanaktivierungsrunden gelangen (Abb. 5). Das Isobutyryl-CoA könnte über Methylmalonylsemialdehyd zu Propionyl-CoA36 oxidiert werden, das zur Regeneration von Fumarat über den Methylmalonyl-CoA-Weg genutzt werden könnte (Abb. 5). Gene für die CO-Dehydrogenase: Acetyl-CoA-Synthase (CODH/ACS) und den umgekehrten Wood-Ljungdahl-Weg (WL) wurden in 'Ca. A. nitratireducens‘, was darauf hindeutet, dass die terminale Oxidation von Acetyl-CoA zu CO2 durch CODH/ACS und schrittweise Dehydrierung der abgeleiteten C1-Einheiten vermittelt werden kann37,38 (Abb. 5; Ergänzende Daten 2; Ergänzende Tabelle 3). Dieser WL-Weg für die CO2-Produktion stimmt mit dem überein, der für das sulfatabhängige Propan abbauende Desulfosarcina aeriophaga BuS521 vorgeschlagen wurde. Derzeit umfasst die Klasse der Symbiobacteriia nur drei Genome in der GTDB-Datenbank und es sind keine Stoffwechselmodelle für den anaeroben Propanstoffwechsel verfügbar. Daher sind weitere Studien erforderlich, um Stoffwechselmodelle für „Ca“ zu erstellen. A. nitratireducens‘, um die Kohlenstoffflüsse für TCA- und WL-Pfade zu berechnen und zu verstehen, wie die Zellen diese beiden Pfade regulieren.

a Teilionenchromatogramme (Ionenübergang, m/z: 289 > 147,2) der angereicherten Kulturextrakte (n = 3, aufgenommen zu verschiedenen Zeitpunkten) zeigten einen Peak bei der Retentionszeit 10,832 min, der mit dem Peak des Isopropylsuccinat-Standards übereinstimmte . b Für Zellextrakte aus der angereicherten Kultur (n = 3 an verschiedenen Probenahmepunkten) wurde ein Peak bei der Retentionszeit 11,078 min (Ionenübergang, m/z: 289 > 147,1) beobachtet, der dem Peak des Propylsuccinat-Standards entspricht. c Phylogenetische Verwandtschaft von 'Ca. AssA (Rot) von A. nitratireducens zu anderen AssA und BssA in der NCBI-Datenbank. Drei AssA-Untereinheiten (AssA123) gefunden in 'Ca. Das MAG von A. nitratireducens bildete einen separaten Cluster. Bootstrap-Werte >90 % werden als schwarze Punkte auf den Zweigknoten angezeigt. Der Maßstabsbalken stellt die Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar.

Die 'Ca. Die Anreicherungskultur von A. nitratireducens nutzte eine Alkylsuccinat-Synthase, um Propan zu n- und iso-Propylsuccinat zu aktivieren. Acetyl-CoA entsteht nach der Umlagerung des Kohlenstoffgerüsts, der Decarboxylierung und der Beta-Oxidation. Die Oxidation von Acetyl-CoA zu CO2 wird durch Enzyme katalysiert, die am oxidativen Tricarbonsäurezyklus oder dem umgekehrten Wood-Ljungdahl-Weg (violette Markierungen) beteiligt sind. 'Ca. A. nitratireducens beherbergte alle Enzyme, die an der Denitrifikation (NapAB, NorB, NosZ, außer NirS/K) und DNRA-Prozessen (NapAB, NrfAH) beteiligt sind (grüner Text). Normalisierte Genexpression für 'Ca. A. nitratireducens wird als TPM (Gesamttranskripte pro Million) angegeben. Eine zunehmende Liniendicke zeigt steigende Genexpressionswerte. In den Proteinextrakten wurden mit blauer, grüner, violetter und fetter Schrift gekennzeichnete Enzyme vollständig oder teilweise identifiziert, während rote Schrift darauf hinweist, dass keine Enzyme nachgewiesen wurden. Alkylsuccinat-Synthase, Ass; Langkettige Acyl-CoA-Synthetase, FadD; Methylmalonyl-CoA-Mutase, Mcm; Propionyl-CoA-Carboxylase, Pcc; Succinat-CoA-Ligase, Suc; Succinat-Dehydrogenase, Sdh; Tricarbonsäure, TCA; CO-Dehydrogenase: Acetyl-CoA-Synthase, CODH/ACS; Methylentetrahydrofolat-Dehydrogenase, Mthfd; Methylentetrahydrofolatreduktase, Mthfr; Formyltetrahydrofolat-Deformylase, Fthd; Formiatdehydrogenase, Fdh; H+-transportierende ATPase vom F-Typ, ATP; NADH-Chinonoxidoreduktase, Nuo; Mehrkomponenten-Na+ H+-Antiporter, Mnh; Menaquinol, MKH2; Menachinon, MK; Nitratreduktase, Nap; Cytochrom c 552 Nitritreduktase, Nrf; Stickoxidreduktase, Nor; Lachgasreduktase, Nr.

Metatranskriptomische und metaproteomische Analysen ergaben, dass Gene, die an den vorgeschlagenen Wegen für die vollständige anaerobe Propanoxidation zu CO2 beteiligt sind, in „Ca“ stark exprimiert wurden. A. nitratireducens‘ und ihre entsprechenden Genprodukte wurden auch in Proteinextrakten nach Propanzugabe nachgewiesen (mit Ausnahmen von Formyltetrahydrofolatdeformylase und Formiatdehydrogenase, Abb. 5; Ergänzende Daten 2), was darauf hinweist, dass ‚Ca. A. nitratireducens spielte sowohl im Stadium 1 als auch im Stadium 2 eine aktive Rolle bei AOP. Eine Suche in der gesamten Metagenombibliothek ergab, dass keine anderen Populationen im System bekannte Gene kodierten, die mit AOP verknüpft sind, einschließlich Gene für ASS20,32 und Alkyl-Coenzym-M-Reduktase22 ,23. Die relative Aktivität koexistierender Mikrobenpopulationen (die zusammen 14–22 % der gesamten Transkriptomablesungen ausmachen) war ebenfalls wesentlich niedriger als die von 'Ca. A. nitratireducens‘ (64–83 % der gesamten Transkriptomablesungen, Abb. 3c). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass „Ca. A. nitratireducens war für AOP im System verantwortlich.

Zellextrakte aus der Anreicherungsbiomasse wurden mittels ultrahochempfindlicher Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie auf Schlüsselmetaboliten des Aktivierungswegs analysiert. Gesamtionenchromatogramme zeigten eine identische Retentionszeit für die Propylsuccinat-Standards und extrahierten Metaboliten (ergänzende Abbildung 12). In den Zellextrakten wurden Massenpeaks festgestellt, die den Standards Isopropylsuccinat (m/z: 289 > 147,2) und Propylsuccinat (m/z: 289 > 147,1) entsprachen (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass „Ca. A. nitratireducens aktiviert Propan durch homolytische CH-Bindungsspaltung an primären und sekundären Kohlenstoffatomen und ergibt unter Zugabe von Fumarat Propylsuccinat und Isopropylsuccinat. Darüber hinaus war Isopropylsuccinat (5,96 nM) in den Kulturextrakten häufiger anzutreffen als Propylsuccinat (2,33 nM), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung des sekundären Kohlenstoffatoms, die Isopropylsuccinat erzeugt, der Hauptweg der Propanoxidation ist (Abb. 5).

Die 'Ca. Das MAG von A. nitratireducens enthält außerdem alle für DNRA erforderlichen Gene (Abb. 5; Ergänzungstabelle 4), einschließlich einer Nitratreduktase (napAB), die die Reduktion von Nitrat zu Nitrit katalysiert, und Cytochrom-c-Nitritreduktasen (nrfAH), die für die Reduktion verantwortlich sind erzeugt Nitrit zu Ammonium. Metatranskriptomische Ergebnisse zeigten, dass napAB-Gene, die von 'Ca. A. nitratireducens wurden im Stadium 1 im Vergleich zu Stadium 2 stärker exprimiert, was mit der höheren Nitratkonzentration im Stadium 1 übereinstimmt (ergänzende Abbildung 13a). Darüber hinaus „Ca. Das nrfAH von A. nitratireducens wurde in Stufe 2 stark exprimiert, wo der Großteil des Ammoniums erzeugt wurde (ergänzende Abbildung 13b). Darüber hinaus wurden die katalytischen Untereinheiten der Nitratreduktase (NapAB) und der Cytochrom-c-Nitritreduktase (NrfA) auch in Proteinextrakten identifiziert (Abb. 5; Ergänzungstabelle 4). Andere Mitglieder der Gemeinschaft exprimierten ebenfalls Gene für dissimilatorische Nitratreduktionswege (Denitrifikation und DNRA; Abb. 3d), jedoch in wesentlich geringeren Mengen im Vergleich zu 'Ca. A. nitratireducens'.

Der Beitrag von 'Ca. Der Zusammenhang zwischen A. nitratireducens und der beobachteten Produktion von Distickstoffgas ist nicht vollständig geklärt, da dem geschlossenen repräsentativen MAG eine identifizierbare Stickoxid produzierende Nitritreduktase (nirS/K) fehlt. Das MAG verfügt über das annotierte Potenzial für die letzten beiden Schritte der Denitrifikation; kodiert Stickoxidreduktase (norB) und Lachgasreduktase (nosZD) für die Umwandlung von Stickoxid in Distickstoffgas (Abb. 5; Ergänzungstabelle 4). Diese Gene wurden in beiden Stadien stark exprimiert und in den Proteinextrakten nachgewiesen (Ergänzungstabelle 4), was darauf hinweist, dass dieser Mikroorganismus zur Reduktion von Stickoxid zu Distickstoffgas beiträgt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass „Ca. A. nitratireducens nutzt möglicherweise ein neues Gen oder einen neuen Weg zur Nitritreduktion zu Stickoxid. Tatsächlich wurde berichtet, dass mehrere andere Mikroben, wie Bacillus vireti und methylotrophe Bakterien, Stickoxid produzieren, obwohl sie keine nirS/K-Gene enthalten39,40,41. Es ist auch möglich, dass andere Mitglieder der Gemeinschaft zur beobachteten Denitrifikation zu Distickstoffgas oder zur Nitritreduktion zu Stickoxid beitragen. Allerdings war die Expression von nirS/K-Genen und anderen Denitrifikationsgenen für alle anderen Populationen relativ gering (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass „Ca. A. nitratireducens war für den Großteil der Stickstoff- und Kohlenstoffumwandlungen im System verantwortlich.

Die Identifizierung eines anaeroben Propan oxidierenden Firmicuts erweitert die bekannte phylogenetische Vielfalt mikrobieller Abstammungslinien, die die anaerobe Oxidation von SCGAs in der Umwelt vermitteln, was zuvor für Mitglieder der Deltaproteobakterien und des archaischen Stammes Halobacteriota gezeigt wurde. Nach unserem Kenntnisstand ist diese Studie die erste, die einen Mikroorganismus identifiziert, der die nitratabhängige anaerobe Propanoxidation (n-DAPO) vermittelt. Angesichts der Verbreitung von Nitrat in verschiedenen natürlichen und künstlich angelegten Ökosystemen in Verbindung mit zunehmenden Propanemissionen in die Atmosphäre aufgrund der Öl- und Erdgasproduktion42 tritt der bisher unbeschriebene n-DAPO-Prozess wahrscheinlich in natürlichen Umgebungen auf und stellt einen übersehenen Zusammenhang zwischen dem globalen Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf dar . Der neu entdeckte n-DAPO-Prozess könnte eine wichtige Rolle bei der Verringerung der negativen Auswirkungen von Propan auf die Luftqualität und das Klima spielen, was weitere Untersuchungen erfordert. Obwohl Propan im Vergleich zu Methan ein weniger wirksames Treibhausgas ist, kann es mit dem Hydroxylradikal reagieren, was zu einer erhöhten Ozonproduktion führt9,43. Außerdem trägt Propan zur Bildung von NO2 und Peroxyacetylnitrat bei, zwei bedeutenden Luftschadstoffen43. Die Identifizierung und Charakterisierung von 'Ca. A. nitratireducens trägt zu einem besseren Verständnis der Rolle von Mikroorganismen bei der Regulierung der SCGA-Emissionen bei.

Alkanivorans (al.ka.ni.vo'rans. NL neut. n. Alkanum, Alkan; L. pres. part. vorans, verschlingend; NL mask. n. Alkanivorans, ein Alkanfresser). nitratireducens (ni.tra.ti.re.du'cens. NL mask. n. nitras (gen. nitratis), Nitrat; L. pres. part. Reducens, in einen anderen Zustand umwandeln; NL Part. Adj. nitratireducens, reduzierend Nitrat). Dieser Name deutet auf einen Organismus hin, der in der Lage ist, Propan zu verbrauchen und stickstoffbezogene Verbindungen zu reduzieren.

Angereichert aus einer Mischung aus anaerobem Vergärungsschlamm und Belebtschlamm aus einer Kläranlage in Brisbane, Australien.

Anaerobe, Propan oxidierende, Nitrat reduzierende Bakterien, die typischerweise als bazillusförmige Zellen mit einer Größe von etwa 0,5 (Durchmesser) × 1,5 µm (Länge) beobachtet werden und manchmal Cluster bilden. Mesophil in Bezug auf Temperatur und pH-Wert (angereichert bei 22–25 °C und pH 7–8).

Ohne einen einfachen Zugang zu Sedimenten in einer propanreichen Umgebung, wie z. B. Gassickern in der Tiefsee oder Sedimenten heißer Quellen, wird eine Mischung aus etwa 100 ml anaerobem Vergärungsschlamm und 50 ml Belebtschlamm aus einer voll ausgestatteten Abwasseraufbereitungsanlage benötigt ( Brisbane, Australien) wurde als Inokulum für die Bioreaktor-Anreicherung verwendet. Abwasser enthält typischerweise eine Vielzahl organischer Substrate, die das Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen ermöglichen. Auch in anaeroben Vergärungssystemen könnten geringe Mengen Propan entstehen44. Wir stellten die Hypothese auf, dass in solchen Systemen einige Propan oxidierende Mikroorganismen vorhanden sein könnten. Das Inokulum wurde in einem 2,3-l-Bioreaktor mit 1,84 l anoxischem synthetischem Medium inkubiert, das wie zuvor beschrieben45 hergestellt wurde, wobei ein Kopfraum von 0,46 l verblieb. Der Propanpartialdruck im Kopfraum wurde durch periodisches Spülen der Flüssigkeit und des Kopfraums mit reinem Propan zwischen 0,9 und 1,4 atm gehalten Propangas (99,99 %, Coregas, Australien). Helium wurde manuell in den Kopfraum injiziert, um den Reaktor auf bis zu 1,5 atm unter Druck zu setzen. Nitrat wurde durch manuelle Injektion einer konzentrierten Stammlösung (80 g NO3-N l-1) pulsweise in den Reaktor eingespeist. Der Bioreaktor wurde kontinuierlich mit einem Magnetrührer (IKA, Labtek, Australien) bei 400 U/min gemischt und bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C) inkubiert. Der pH-Wert wurde durch manuelle Zugabe von 1 M anoxischer HCl-Lösung auf einen Wert zwischen 7 und 7,5 eingestellt. Alle 1–3 Monate wurden 200 ml des Überstands durch frisches synthetisches Medium ausgetauscht. Zur Messung von Nitrat, Nitrit und Ammonium wurde 2–3 Mal pro Woche eine Flüssigkeitsprobe (ein ml) über die Probenahmeöffnung des Bioreaktors entnommen und auf 0,22 μm gefiltert (Polyethersulfonfilter, Millex, USA). Zur Messung von Propan- und Distickstoffgas wurde zwei- bis dreimal pro Woche mit einer gasdichten Spritze (Hamilton, USA) eine Gasprobe (100 μl) aus dem Kopfraum entnommen.

Zur stöchiometrischen Bestimmung der Nitratreduktion und der anaeroben Propanoxidation wurden vom Tag 990 bis zum Tag 1000 neben Nitrat, Nitrit und Ammonium auch die Propan- und Stickstoffkonzentrationen im Kopfraum des 2,3-l-Bioreaktors regelmäßig gemessen. Darüber hinaus wurden auch zwei Chargentests durchgeführt 650-ml-Glasgefäße mit einer Teilprobe von 500 ml Biomasse, die anaerob aus dem 2,3-l-Bioreaktor übertragen wurde (Ergänzungstabelle 5). Anschließend wurde die Biomasse 20 Minuten lang mit Argongas (99,99 %, Coregas, Australien) gespült, um gelöstes Propan in der Flüssigkeit zu entfernen. Als einziger Elektronendonor wurden etwa 45 ml Propangas in den Kopfraum gegeben. Als Kontrollen wurden angereicherte Kulturen ohne Propan und steriles synthetisches Medium mit Propan angelegt (Ergänzungstabelle 5). Jeder Chargentest wurde dreifach durchgeführt.

Für die Isotopenmarkierungsexperimente wurde eine Teilprobe von 500 ml Biomasse aus dem Bioreaktor anaerob in ein 650 ml Glasgefäß überführt. Die Biomasse wurde 20 Minuten lang mit reinem Propangas (99,99 %, Coregas, Australien) gespült. Ungefähr 12 ml 13C-markiertes Propan (13CH313CH213CH3, 99 Atom-% 13C, Sigma) wurden durch das Septum in den Kopfraum injiziert. Etwa 1 ml Nitrat-Stammlösung (10 g NL-1), die etwa 1 % 15N-markiertes Natriumnitrat (98 Atom-% 15N, Sigma) enthielt, wurde zugegeben, um eine Konzentration von etwa 20 mg NL-1 zu erreichen. Mit einer gasdichten Spritze wurden regelmäßig Gasproben aus dem Kopfraum entnommen (Hamilton, USA) und dann in mit Helium gespülte Fläschchen (Exetainer, UK) injiziert. Flüssige Proben wurden gesammelt, gefiltert (0,22 μm) und bis zur Analyse auf 15NO3−, 15NO2− und 15NH4+ bei –20 °C gelagert. Um das in der flüssigen Phase erzeugte CO2 zu quantifizieren, wurden ungefilterte Proben in Exetainer-Fläschchen injiziert, mit 1 M HCl-Lösung angesäuert und vor der CO2-Bestimmung mindestens 0,5 Stunden lang mit dem Kopfraum äquilibriert.

Die Nitrat-, Nitrit- und Ammoniumkonzentrationen in gefilterten Proben wurden mit einem Lachat QuickChem8000 Durchflussinjektionsanalysator (Lachat Instrument, Milwaukee, WI) bestimmt. Die Propan-, Stickstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen im Kopfraum wurden mit einem Gaschromatographen (GC, 7890 A, Agilent, USA) quantifiziert, der mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor und einer gepackten Shincarbon ST-Säule (2 m × 2,0 mm) ausgestattet war. Der Gaschromatograph wurde mit Argon als Trägergas betrieben (Durchflussrate 28 ml/min). Die Ofen-, Injektor- und Detektortemperaturen wurden bei 220, 250 bzw. 260 °C gehalten. Die Propan-, Stickstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen wurden anhand einer externen Standardkurve berechnet.

Isotopenmarkierte Proben, die Nitrat und Nitrit enthielten, wurden in zwei gleiche Teilproben aufgeteilt. Für eine Teilprobe wurden die Nitrat- und Nitrit-15N-Fraktionen mit einem Thermo Delta V-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS) nach Umwandlung in N2O46 gemessen. Bei der anderen Teilprobe wurde Nitrit mit 4 % (Gew./Vol.) Sulfaminsäure in 10 % HCl47 entfernt und der 15N-Anteil im verbleibenden Nitrat wurde mittels IRMS gemessen. Der Anteil von 15N im Nitrit wurde dann unter Verwendung der Gleichung berechnet: 15N-Anteile in (NO3− + NO2−) × Gesamtmenge an (NO3− + NO2−) = 15N-Anteil in NO3− × Gesamtmenge an NO3− + 15N-Anteil in NO2− × Gesamtmenge an NO2−. Mithilfe einer Mikrodiffusionsmethode48,49 wurde Ammonium in GF/D-Filtern (Whatman, UK) eingefangen, die dann zur Isotopenanalyse mittels IRMS verbrannt wurden. 29N2, 30N2, 13C-markiertes Propan und 13CO2 in Gasproben wurden mit einem Gaschromatographen (7890 A, Agilent, USA) bestimmt, der an ein Quadrupol-Massenspektrometer (5957 C inert MSD, Agilent, USA) gekoppelt war. Der Gaschromatograph war mit einer J&W HP-PLOT Q PT-Säule (30 m × 530 μm) ausgestattet und wurde mit Helium als Trägergas betrieben (Flussrate 5,58 ml/min). Der Ofen wurde 2 Minuten lang auf 45 °C gehalten und dann mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/Minute auf 60 °C erhitzt, wo er 6 Minuten lang gehalten wurde. N2, CO2 und C3H8 wurden bei 70 eV Elektronenstoß (EI) unter Verwendung des Standard-Autotune-Verfahrens zur Massenkalibrierung nachgewiesen. Die Erfassung erfolgte mittels Totalionenchromatographie (TIC) zur Identifizierung und mittels Selected Ion Monitoring (SIM) zur Überwachung von m/z-Signalen bei 28, 29 und 30 Da (N2), 44 und 45 Da (CO2), 44 und 47 Da ( C3H8) mit einer Verweilzeit von 100 ms für jedes Signal. Die Datenverarbeitung wurde mit dem Chemstation-Programm (Agilent, USA) durchgeführt.

Alle 2–3 Monate wurden Biomasseproben (10 ml) aus dem Anreicherungsbioreaktor entnommen und zur DNA-Extraktion durch Zentrifugation (8000 × g für 10 Minuten) pelletiert. Die DNA wurde mit dem FastDNA SPIN for Soil Kit (MP Biomedicals, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die DNA-Konzentrationen wurden mit einem Nanodrop-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) gemessen. Die Amplikonsequenzierung für die 16 S-rRNA-Gene (V6- bis V8-Regionen) wurde unter Verwendung des universellen Primersatzes 926 F (5ʹ-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3ʹ) und 1392 R (5ʹ-ACGGGCGGTGTGTRC-3ʹ)50 auf einer Illumina MiSeq-Plattform (Illumina, USA) durchgeführt ) am Australian Centre for Ecogenomics (ACE; Brisbane, Australien). Die Sequenzierungsergebnisse wurden mit QIIME250 verarbeitet.

Die an Tag 1040 (für das anfängliche Metagenom) und Tag 1100 (für das flache Metagenom) extrahierte DNA wurde über Short-Read-Paired-End-Bibliotheken unter Verwendung eines Illumina Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskits und der NextSeq500-Plattform (Illumina, USA) bei ACE sequenziert , basierend auf dem Protokoll des Herstellers. Proben für die flache metagenomische Sequenzierung wurden gleichzeitig mit Proben für die metatranskriptomische Sequenzierung entnommen, um sicherzustellen, dass die mikrobielle Gemeinschaft mit dem ursprünglichen Metagenom übereinstimmt (ergänzende Abbildung 14). Die Bibliotheken generierten durchschnittlich 149 Millionen bzw. 1 Million Lesevorgänge für das anfängliche bzw. flache Metagenom (Ergänzungsdaten 1). Duplikate, Adapter und Basen mit schlechter Qualität in generierten Lesevorgängen wurden mit ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) mit dem Parameter „–remove_dups–minlen 100“ entfernt, der intern FastQC (https://www.bioinformatics.babraham) aufruft .ac.uk/projects/fastqc/), FastUniq-1.151, cutadapt 2.10 und Trimmomatic-0.3652.

Biomasse aus dem Batch-Reaktor (Tag 1120) wurde ebenfalls einer Nanopore-Long-Read-Sequenzierung unterzogen. Die DNA wurde mit dem Qiagen PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Deutschland) extrahiert und mit einer Kombination aus dem Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit auf dem Qubit Flex Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) und dem QIAxcel DNA High Resolution Kit auf Qualität überprüft das QIAxcel Advanced-System (Qiagen, Deutschland). Die Bibliotheksvorbereitung wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers abgeschlossen und auf einem PromethION (Oxford Nanopore Technologies, USA) sequenziert. Base-Calling wurde mit Albacore (https://github.com/Albacore/albacore) durchgeführt, was zu 73 Millionen Lesevorgängen mit einer Qualität > Q5 führte. Darunter waren 12 Millionen Lesevorgänge länger als 1000 bp mit einem Lese-N50 von 6.135 bp. Adapter wurden mit Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop) zugeschnitten.

Aviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) wurde für die hybride Assemblierung und Binning von kurzen und langen Lesevorgängen verwendet, wobei intern mehrere verschiedene Assembler und Binning-Tools aufgerufen wurden. Die Ergebnisse wurden manuell mit Bandage53 überprüft. Die resultierenden Bins wurden mit DASTools 1.1.254 organisiert. Wiederhergestellte Genome wurden mithilfe des „Dereplicate“-Workflows in drep-3.2.255 mit Standardeinstellungen weiter derepliziert, was zu einem nicht redundanten Genomsatz bestehend aus 59 hochwertigen Genomen führte. Die Abdeckung der Genominformationen und andere Details wurden mit IGV 2.11.156 angezeigt und manuell überprüft. Vollständigkeit und Kontamination der Genome wurden mit CheckM v1.1.357 überprüft. Auf die Qualität reduzierte Short-Reads wurden mithilfe von Bowtie 2.3.4.3 dem endgültigen MAG-Set und den nicht eingeteilten Contigs zugeordnet. Zuordnungen mit einem ausgerichteten Längenverhältnis über einen Lesevorgang von <75 % oder einer Identität der ausgerichteten Region <97 % wurden entfernt. Die Häufigkeit jedes MAG wurde mit CoverM 0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) nur mit hochwertigen Primärkartierungen profiliert. NGA50 und andere Genommerkmale wurden mit dem Python-Paket BioSut (https://github.com/jlli6t/BioSut) berechnet.

Für alle MAGs und nicht gruppierten Contigs wurden offene Leserahmen (ORFs) aufgerufen und die primäre Annotation von Genomen wurde unter Verwendung von Prokka 1.14.558 mit der aus der GTDB-Tk-Klassifizierung abgeleiteten Domäne durchgeführt. Die KEGG Orthology HMM-Datenbank (abgerufen im Juli 2021) wurde mit kofamscan 1.3.059 durchsucht, wobei der höchste Treffer für jedes Gen mit einem E-Wert <1e-10 und einem maximalen F-Maß ausgewählt wurde. UniRef10060 (abgerufen im März 2020) wurde mit der NCBI-Taxonomiedatenbank indiziert und gegen die Verwendung von Diamond61 v2.0.11.149 mit „blastp–sensitiv“ gesucht. Der Top-Treffer mit einem E-Wert <1e-5 und einer Identität > 30 wurde ausgewählt und der KEGG Orthology-Datenbank zugeordnet. Die Datenbank eggNOG v5 wurde mit emapper 2.1.5 im Diamantmodus durchsucht. Konservierte Motive, die in den vorhergesagten Genen im Zusammenhang mit der Propanoxidation und dem Stickstoffstoffwechsel vorhanden sind, wurden mithilfe der konservierten Domänensuche von NCBI weiter verifiziert62. Annotierte KO-Nummern wurden verwendet, um den in jedem Genom kodierten Signalweg abzuleiten. Pfade wurden als „nicht ausgedrückt“ identifiziert, wenn fehlende Blöcke > 75 % und die Gesamtblockzahl > 5 war, oder fehlende Blöcke > 1, wenn die Gesamtblockzahl ≤ 5 war.

Mithilfe der Genome Taxonomy Database (GTDB r202) wurde ein Bakteriengenombaum erstellt und Bakteriengenome mit einem verketteten Satz von 120 bakterienspezifischen konservierten Markergenen gewonnen, die aus Genomen abgeleitet wurden. Kurz gesagt, Markergene in Genomen wurden mit Prodigal 2.663 identifiziert und mit HMMER 3.364 abgeglichen. Bäume wurden mit FastTree 2.1.1165 mit WAG + GMMA-Modellen abgeleitet. Das Bootstrapping wurde mit GenomeTreeTk v0.1.6 (https://github.com/dparks1134/GenomeTreeTk) mit 100-fachem nichtparametrischem Bootstrapping durchgeführt. Bäume wurden mit ARB 6.0.666 visualisiert und zur weiteren Verfeinerung in Adobe Illustrator (Adobe, USA) importiert. Die Klassifizierung von Genomen wurde mithilfe des Workflows „classify_wf“ in GTDB-Tk v1.5.167 bestimmt.

Die 16S-rRNA-Gene wurden im 'Ca. A. nitratireducens‘ MAG und öffentlich verfügbare Symbiobacteriia-Genome in der Datenbank. Diese Gene wurden mit der SILVA 138 SSU-Datenbank verglichen. Ausgewählte Sequenzen und vorhergesagte 16S-rRNA-Gensequenzen wurden unter Verwendung von cd-hit 4.8.168 derepliziert. Insgesamt wurden 112 16S-rRNA-Sequenzen gesammelt und mit SSU-align v0.1.169 ausgerichtet. Der phylogenetische Baum wurde mit FastTree 2.1.1165 mit den Parametern „-gtr -gamma“ abgeleitet.

Für phylogenetische Analysen von AssA in 'Ca. A. nitratireducens‘, 24 Referenz-AssA- und BssA-Proteinsequenzen, länger als 700 Aminosäuren (Zugangsnummern der Referenzsequenzen sind in der Ergänzungstabelle 6 angegeben), wurden aus öffentlichen Datenbanken heruntergeladen und unter Verwendung von Muscle 3.8.3170 mit dem Parameter „-diags1 –“ abgeglichen. Maxiter 5'. Lücken im MSA wurden mit trimAI 1.4.171 geschlossen. Der phylogenetische Baum wurde mit FastTree 2.1.1165 abgeleitet. Für die Konstruktion sowohl des 16S-rRNA-Gens als auch des AssA-Aminosäurebaums entsprachen die Berechnung des Bootstrap-Werts und die Baumvisualisierung der Konstruktion des Genombaums.

Dreifache Chargentests wurden am Tag 1100 in drei 650-ml-Glasgefäßen mit einer Teilprobe von 500 ml Biomasse in jedem Gefäß durchgeführt. Die Nitratreduzierung in Bioreaktoren wurde in zwei Stufen unterteilt. In Stufe 1 wurde Nitrat hauptsächlich in Nitrit- und Distickstoffgas mit vernachlässigbarer Ammoniumproduktion umgewandelt, während in Stufe 2 sowohl Ammonium als auch Distickstoffgas produziert wurden. Für die Co-Extraktion von Gesamt-RNA und DNA wurden 10 ml einer aktiven angereicherten Kultur aus jedem Chargentest in jeder Phase gesammelt und durch Zugabe von RNAlater-Lösung (Sigma-Aldrich) konserviert und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die Mischung durch einen sterilisierten Cellulosenitratfilter (0,20 μm; Sartorius; Göttingen, Deutschland) filtriert. Um Mikroorganismen abzufangen, die den 0,2-μm-Filter passieren könnten, wurde das Filtrat unter Verwendung eines Amicon® Ultra Filters (Sigma-Aldrich) mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 100 K weiter konzentriert. Gesamt-RNA und DNA im konzentrierten Filtrat und Cellulosenitratfilter wurden dann mit dem RNeasy Powersoil Total RNA Kit mit dem RNeasy PowerSoil DNA Elution Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Protokollen des Herstellers extrahiert. Spuren genomischer DNA wurden mit einem Turbo DNA-freien Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) und anschließend mit einem RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research, USA) aus den RNA-Extrakten entfernt. Das TruSeq Total RNA Library Prep with Ribo-Zero Plus-Kit wurde für die RNA-Bibliotheksvorbereitung gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Die Bibliothek wurde auf einer NextSeq500-Plattform (Illumina, USA) bei ACE (Brisbane, Australien) in 2 × 75 Zyklen Paired-End-Läufen sequenziert (Tabelle S1).

Generierte Lesevorgänge wurden mit ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) mit dem Parameter „–remove_adap –minlen 60“ gekürzt. Eine rRNA-Datenbank wurde aus archaischer und bakterieller 5 S-rRNA aus 5SRNAdb72, einer SSU-Datenbank aus SILVA73 v138 und einer LSU-Datenbank aus SILVA v132 erstellt. Ribosomale RNA-ähnliche Lesevorgänge wurden mit SortMeRNA 4.2.074 mit den Standardeinstellungen und der oben beschriebenen Datenbankkonstruktion entfernt. Qualitätsreduzierte Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie2 einem dereplizierten MAGs-Satz und nicht gruppierten Gerüsten zugeordnet. Alignments mit einer ausgerichteten Länge <95 % der Leselänge oder einer Identität <97 % wurden entfernt. Mögliche DNA-Kontaminationen von RNA-Bibliotheken wurden mithilfe von RNAdir (https://github.com/jlli6t/RNAdir), einer modifizierten Version von dirseq (https://github.com/wwood/dirseq), identifiziert. Anschließend wurde ein Binomialtest mit der Funktion scipy.stats.binomtest durchgeführt. Zur Berechnung des TPM (Total Transcripts Per Million)75 wurden Zuordnungen verwendet. Die Gesamtexpressionsniveaus jedes Genoms wurden als Summe der TPM aller kodierenden Sequenzen innerhalb jedes Genoms berechnet.

Zur Proteinextraktion wurden 10 ml Anreicherungskultur aus Transkriptomik-Chargentests durch Zentrifugation (18.000 × g, 4 °C) pelletiert, mit 1 × PBS gewaschen und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Die Zellpellets wurden in 5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert, mit 20 mM Dithiothreitol (Endkonzentration) 60 Minuten bei 70 °C inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, gefolgt von einer Alkylierung mit 40 mM Iodacetamid (Endkonzentration). 30 Min. im Dunkeln. Anschließend wurden 1,2 % Phosphorsäure (Endkonzentration) und sechs Volumina S-Trap-Bindungspuffer (90 % Methanol, 100 mM Endkonzentration Ammoniumbicarbonat, pH 7,1) zugegeben. Das Gesamtprotein wurde in einer S-Trap Micro Spin Column (ProtiFi, Huntington, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers verdaut76. Kurz gesagt wurde die Proteinlösung auf den S-Trap-Filter geladen und bei 4.000 g zentrifugiert, bis die gesamte Lösung durchgelaufen war. Der Filter wurde dreimal mit 150 μl S-Trap-Bindungspuffer gewaschen und mit 1 μg Trypsin in Sequenzierungsqualität 1 Stunde lang bei 47 °C verdaut. Die verdauten Peptide wurden nacheinander mit 40 µl 50 mM Ammoniumbicarbonat, 0,1 % wässriger Ameisensäure, 50 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure in H2O eluiert. Die Peptidlösungen wurden getrocknet, bevor sie in 20 µl 5 % Acetonitril in H2O resuspendiert wurden. Die Peptide wurden mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unter Verwendung eines Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-LC-Systems analysiert, das an ein Q-ExactiveTM HX Hybrid Quadrupole-Orbitrap™-Massenspektrometer (Thermo ScientificTM) gekoppelt war. Rohe Sequenzierungsdaten wurden durch Suche anhand der annotierten Metagenome von 'Ca verarbeitet. A. nitratireducens' im Thermo Proteome Discoverer (Version 2.2.0.388). Die identifizierten Proteine enthielten mindestens ein einzigartiges Peptid mit einem Stringenz-Cut-off der Falscherkennungsrate (FDR, q-Wert) von weniger als 0,05.

Zur Herstellung des Metabolitenextrakts wurden 5 ml Anreicherungskultur aus dem Bioreaktor entnommen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (8000 × g, 10 min, 4 °C) geerntet und dann in 1 ml Acetonitril-Methanol-Wasser-Gemisch (4:4:2, Vol./Vol./Vol.) in lysierenden Matrixröhrchen (MP Biomedicals) resuspendiert ) mit Glasperlen. Die Zellen wurden unter Verwendung eines auf Kügelchen basierenden Homogenisators lysiert, der fünf Zyklen hin- und hergehenden Schüttelns bei niedriger Geschwindigkeit (3000 U/min, 50 s) unter Kühlung auf Eis (15 s) zwischen den Homogenisierungsschritten durchführte. Die Extrakte wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 18.000 g und 4 ° C von Zelltrümmern und Glasperlen getrennt und bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert.

Die individuell synthetisierten Standards (Propyl- und Isopropylsuccinat, Best of Chemicals, USA) und Zellextrakte wurden in einem Rotationsvakuumkonzentrator (Concentrator Plus, Eppendorf) getrocknet und dann in 20 μl Methoxyaminchlorid (30 mg/ml in Pyridin) derivatisiert kontinuierliches Mischen für 2 Stunden bei 37 °C. Anschließend wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA, 20 μl) mit 1 % Trimethylchlorsilan (TMCS) zugegeben. Die Proben wurden unter kontinuierlichem Schütteln 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und dann mit einem ultrahochempfindlichen Triple-Quadrupol-GC/MS-TQ8050-System (Shimadzu, Japan) analysiert. Das GC-System war mit einer EI-Ionisationsquelle ausgestattet und wurde im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) zum Nachweis von Verbindungen betrieben. Als Trägergas wurde Helium mit einer konstanten Flussrate von 1,0 ml/min verwendet. Ein Mikroliter der derivatisierten Probe wurde im Split-Modus 1:10 mit einer Injektionstemperatur von 280 °C in einen PTV-Injektor injiziert. Die Trennungen wurden in einer DB-5ms-Säule (95 % Polydimethylsiloxan, 30 m × 0,25 mm × 1 μm) (Agilent JW Scientific) durchgeführt. Die Ofentemperatur wurde zunächst 1 Minute lang bei 120 °C gehalten, dann mit einer Geschwindigkeit von 8 °C/Minute auf 220 °C erhöht und schließlich mit 50 °C/Minute auf 320 °C erhöht und 1 Minute lang gehalten. Die Temperatur der Ionenquelle wurde auf 200 °C eingestellt. Die spezifischen massenspektrometrischen Parameter wurden für jede Verbindung maßgeschneidert, um die Fragmentierungsionen für jeden Analyten zu überwachen (siehe Ergänzungstabelle 7). Zwei Fragmentionen aus der EI-Ionenquelle wurden nominiert und dann in der Kollisionszelle weiter fragmentiert. Zur Überwachung wurden die drei häufigsten Transienten ausgewählt. Transient 1 wurde als Quantifizierer und die anderen beiden als Qualifizierer verwendet.

FISH wurde im Wesentlichen wie von Daims et al.77 beschrieben durchgeführt. Biomasse aus dem Bioreaktor wurde mit 4 % Paraformaldehyd (Gew./Vol.) fixiert und in 50 % Ethanol in PBS bei –20 °C gelagert. FISH-Sonden wurden mit der ARB-Software70 anhand der Silva SSU Ref NR99-Datenbankversion 13873 entworfen, einschließlich relevanter Sequenzen, die aus dem Anreicherungsbioreaktor generiert wurden. In Ermangelung jeglicher verwandter Sequenzen in der Datenbank (>92 % Ähnlichkeit) wurden die Sonden gegen die 16 S-Sequenz von 'Ca entworfen. A. nitratireducens‘ und bei ihrer Anwendung außerhalb gut charakterisierter Systeme ist Vorsicht geboten. Da keine kultivierten Vertreter für die Sondenvalidierung verfügbar sind, wurden drei FISH-Sonden entwickelt, um auf verschiedene Stellen auf dem 'Ca. A. nitratireducens‘ 16 S-rRNA, um ein höheres Vertrauen in ihre Spezifität zu schaffen. Dazu gehörten SYMB-1018 (5ʹ – CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) und SYMB-186 (5ʹ – TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ). ) Sonden. Unmarkierte Helfersonden78 wurden entwickelt, um auf die flankierenden Regionen jeder Sondenstelle abzuzielen, um die Zugänglichkeit zur Zielstelle für ein optimales Fluoreszenzsignal zu verbessern (SYMB-1018: H1, 5′ – ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3′; H2, 5′ – CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Hilfssonden wurden in äquimolaren Mengen mit ihrer jeweiligen Sonde angewendet. Die 5′- und 3′-Enden der Oligonukleotid-FISH-Sonden wurden mit dem Cy3-Fluorophor markiert und von Integrated DNA Technologies, Singapur, synthetisiert. Ein höheres Signal wurde für diese FISH-Sonden mit Lysozym-Vorbehandlung der Biomasse (0,5 mg ml−1 in 0,05 M EDTA, 0,1 M Tris-HCl, pH 8) für 30 Minuten bei Raumtemperatur erreicht. Die Non-EUB-Nonsense-Sonde wurde als negative Hybridisierungskontrolle verwendet79. Die DAPI-Färbung (1 ng/µl) der Zellen wurde 15 Minuten lang im Dunkeln durchgeführt. Die markierte Biomasse wurde mit einem konfokalen Weißlichtlasermikroskop Stellaris5 (Leica, Deutschland) sichtbar gemacht.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten werden in der NCBI-Datenbank unter der Projektnummer PRJNA802347 archiviert. Alle Entwürfe der Nukleotidsequenzen des Genoms wurden dem NCBI unter den Zugangsnummern SAMN25643198 bis SAMN25643256 übermittelt. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD031366 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken A. Oren (Hebräische Universität Jerusalem) für Vorschläge zur Benennung von „Ca. A. nitratireducens‘, G. Talbo und L. Liu für Hilfe bei der Proteinextraktion und Proteomik-Datenanalyse, Y. Wang und C. Lai für Unterstützung beim Bioreaktorbetrieb, X. Zhang und S. Hu für die Wartung des Gaschromatographen, N. Clayton, N. Dawson und J. Li für chemische Analysen, A. Tabrett und A. McInnes für Hilfe bei der Optimierung der FISH-Sonden und E. Larsen für Unterstützung bei der Bearbeitung. JL wird durch das UQ Research Training Scholarship unterstützt. JG, SM und GT werden durch die Future Fellowships FT170100196, FT190100211 und FT170100070 des Australian Research Council (ARC) unterstützt. ZY wird vom ARC Australian Laureate Fellowship (FL170100086) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mengxiong Wu, Jie Li.

Australisches Zentrum für Wasser- und Umweltbiotechnologie, Fakultät für Ingenieurwesen, Architektur und Informationstechnologie, University of Queensland, St. Lucia, Queensland, Australien

Mengxiong Wu, Jie Li, Zhiguo Yuan und Jianhua Guo

Zentrum für Mikrobiomforschung, School of Biomedical Sciences, Queensland University of Technology (QUT), Translational Research Institute, Woolloongabba, QLD, Australien

Andy O. Leu, Gene W. Tyson und Simon J. McIlroy

Zentrum für Küstenbiogeochemieforschung, Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Southern Cross University, Lismore, NSW, Australien

Dirk V. Erler

Metabolomics Australia (Queensland Node), Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland, St. Lucia, QLD, 4072, Australien

Terra Stark

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JG konzipierte die Studie. MW, JG und SM planten die Experimente. MW reichert die Mikroorganismen im Bioreaktor an und führt Experimente zur Massen- und Elektronenbilanz sowie zur Isotopenmarkierung durch. DE führte die Isotopen-Stickstoffmessungen durch. TS hat Methoden für die Isotopen-Kohlenstoff- und Metabolitenanalyse entwickelt. SM entwarf FISH-Sonden und führte FISH-Mikroskopie durch. MW führte die Probenahme, Konservierung, DNA-, RNA- und Proteinextraktion für die Metagenomik-, Metatranskriptomik- und Metaproteomik-Sequenzierung durch. MW, JG und ZY führten die Prozessdatenanalyse durch. JLAL, MW, GT, SM und JG führten die Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft und die bioinformatische Analyse durch. MW, JL, ZY, SM und JG haben das Manuskript in Absprache mit allen anderen Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Simon J. McIlroy oder Jianhua Guo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Florin Musat und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, M., Li, J., Leu, AO et al. Anaerobe Oxidation von Propan gekoppelt mit Nitratreduktion durch eine Abstammungslinie innerhalb der Klasse Symbiobacteriia. Nat Commun 13, 6115 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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Eingegangen: 12. April 2022

Angenommen: 05. Oktober 2022

Veröffentlicht: 17. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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