Identifizierung von 2,4 - Shijiazhuang Chemicals Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14292 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Verbindung 2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG) ist ein Breitbandantibiotikum, das hauptsächlich von Pseudomonas spp. produziert wird. DAPG spielt eine wichtige Rolle bei der biologischen Bekämpfung von Krankheiten und unterdrückt die Aktivität von Pseudomonas spp. In der aktuellen Studie berichten wir über die Entdeckung des DAPG-Biosyntheseclusters in Stämmen von Chromobacterium vaccinii, die aus brasilianischen Gewässern isoliert wurden, und über die Verteilung des Biosyntheseclusters in der Gattung Chromobacterium. Die phylogenetische Analyse des phlD-Proteins legt nahe, dass der Biosynthesecluster wahrscheinlich nach einem horizontalen Gentransfer mit einem Mitglied der Pseudomonas fluorescens-Gruppe in die Gattung Chromobacterium gelangte. Wir konnten Spuren von DAPG in Wildtypkulturen nachweisen und die Funktion des Clusters mit heterologer Expression in Escherichia coli bestätigen. Darüber hinaus haben wir das Vorhandensein anderer Sekundärmetaboliten in diesen Stämmen identifiziert und verifiziert. Wir haben auch die Fähigkeit von C. vaccinii-Stämmen bestätigt, das bioaktive Pigment Violacein und das bioaktive zyklische Depsipeptid FR900359 zu produzieren. Es wurde berichtet, dass beide Verbindungen antimikrobielle und insektizide Wirkungen haben. Diese Verbindungen legen nahe, dass C. vaccinii-Stämme weiter auf ihr Potenzial als Biokontrollmittel untersucht werden sollten.

Die Verbindung 2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG) ist ein Breitbandantibiotikum, das ursprünglich aus einem fluoreszierenden Pseudomonas-Stamm1 isoliert wurde. DAPG wird durch einen Typ-III-Polyketid-Synthase-Cluster synthetisiert, der das phlABCDE-Operon2,3 umfasst. Die Synthese wird durch das phlD-Gen initiiert, das Phloroglucinol aus Malonyl-CoA2 produziert. Anschließend wird Phloroglucinol zu Monoacetylphloroglucinol (MAPG) acyliert, und eine zweite Acylierung führt zur Produktion von DAPG4.

Anschließend kann dieses Molekül zur Unterdrückung krankheitsverursachender Organismen im Boden verwendet werden und ist ein wichtiger Bestandteil von „krankheitsunterdrückenden Böden“5 und in Biokontrollanwendungen6. DAPG ist hochwirksam bei der Bekämpfung des Erregers des „Gesamtrückgangs“ bei Weizen (Gaeumannomyces tritici)7 und der „Tabakschwarzwurzelfäule“ (Thielaviopsis basicola)8. Zusätzlich zur Bekämpfung dieser Pilz-Ascomyceten wurde berichtet, dass DAPG den Oomyceten Pythium ultimum9 und das gramnegative Bakterium Erwinia carotovora subsp. hemmt. atroseptica10 und das grampositive Bakterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis11. Die Ökologie und der Einsatz von DAPG in Biokontrollanwendungen werden weiterhin intensiv untersucht12,13,14.

Chromobacterium-Arten gehören zur gramnegativen Bakterienklasse Betaproteobacteria. Chromobacterium-Stämme wurden aus vielen Gründen untersucht, beispielsweise wegen ihrer Fähigkeit, ein opportunistischer Krankheitserreger zu sein15 und als Modellsystem für das Quorum Sensing bei gramnegativen Bakterien16. Chrombakterien sind eine reichhaltige Quelle bioaktiver Moleküle17,18,19. Kürzlich wurden sie als Biokontrollmittel zur Bekämpfung von Insektenschädlingen20,21 und Pflanzenpathogenen22,23,24,25 eingesetzt und entwickelt.

Während wir in dieser Studie die Diversität von Chromobacterium in einem brasilianischen Flusssystem untersuchten, identifizierten wir Stämme von Chromobacterium vaccinii, die einen Polyketid-Synthase-Biosynthesecluster mit Homologie zum phlACBDE-Operon26 besaßen. Dies lieferte die Motivation, die Verteilung dieses Clusters in Chromobacterium spp. zu bestimmen. und bestätigen Sie die Bioaktivität des Clusters.

Der Typstamm von C. vaccinii DSM 25150T wurde direkt von der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bezogen. Chromobacterium vaccinii CR1 und CR5 wurden zuvor aus Gewässern in Brasilien isoliert26. Beide Stämme wurden aus rohem Oberflächenwasser isoliert, das direkt in sterilen Flaschen aus dem Gewässer zwischen 0 und 30 cm Wassertiefe gesammelt wurde, wobei die Sammlung und Aufbewahrung der Proben gemäß dem National Collection Guide und der Aufbewahrung von Proben erfolgte : Wasser, Sedimente, Wassergemeinschaften und flüssige Abwässer27. C. vaccinii CR1 wurde aus dem Bach João Leite, Goiânia, Goiás, Brasilien isoliert – Geografische Lage 16° 34′ 30,54" S; 49° 13′ 55,02" WC vaccinii CR5 wurde aus dem Fluss Meia Ponte, Goiânia, Goiás, Brasilien isoliert – geografische Lage 16° 54′ 16,3'' S; 49° 07′ 37,8'' W. Die Isolationsdetails entsprachen Gomes et al.28.

Die aquatische Umgebung, aus der die Stämme CR1 und CR5 isoliert wurden, ist ein Fluss und sein Nebenfluss. Diese Gewässer sind auch zahlreichen anthropologischen Belastungen ausgesetzt, wie z. B. industriellen und agroindustriellen Aktivitäten (Viehhaltung und intensive Produktion von Gartenbauprodukten) und werden außerdem für Freizeitzwecke genutzt. Das Klima des Beckens ist tropisch mit zwei klar definierten Jahreszeiten, trocken und regnerisch, die zum Cerrado-Biom28 gehören.

Die Website-Version der antiSMASH 6.0-Software wurde verwendet, um mutmaßliche Sekundärmetabolitencluster in den Genomen von C. vaccinii CR1, CR5 und DSM 25150T29 zu identifizieren. Cluster, die in der antiSMASH 6.0-Software nicht zuverlässig zugeordnet wurden, wurden manuell mit der BLAST-Software durchsucht, um eine mögliche Funktion zu ermitteln. Um die Verteilung des DAPG-Clusters zu bestimmen, wurde der Cluster (identifiziert als GenBank LQR3212800..LQR32_12830) als Referenz verwendet. Diese Loci wurden manuell mit der BLAST-Software anhand aller verfügbaren Genome (Stand 1. Juni 2022) in der Gattung Chromobacterium durchsucht. Zusätzlich zu den biosynthetischen Genen des DAPG-Clusters (phlACBDE) suchten wir nach dem regulatorischen Gen, das mit dem Cluster (phlF, phlG, phlH) assoziiert ist und häufig in Pseudomonas-Stämmen vorkommt. Als Referenz wurde die Zugangsnummer CM001558 verwendet.

Das Kerngenom für die Gattung Chromobacterium wurde mit dem BIGSdb-Programm30 bestimmt und abgeglichen. Aquitalea magnusonii DSM 23134T wurde als Fremdgruppe aufgenommen. Der phylogenetische Baum wurde mit der Software MEGA 1131 erstellt. Der nachbarschaftlich verbundene Baum wurde mithilfe des Tamura-Nei-Modells (0,40, Gammaverteilung mit invarianten Standorten) bestimmt. Messungen der Bootstrap-Unterstützung für interne Zweige wurden aus 1000 Pseudoreplikaten ermittelt. Für die PhlD-Phylogenie wurde das PhlD-Protein im Genom von C. vaccinii CR1 identifiziert und mithilfe der BLAST-Software nach allen verfügbaren nicht-redundanten Proteinen in der GenBank gesucht. Alle in der Gattung Chromobacterium verfügbaren Proteine (9) wurden in das Alignment einbezogen. Aufgrund der großen Anzahl verfügbarer Pseudomonas-Proteine wurde nur eine repräsentative Stichprobe (11) einbezogen. Ein Streptomyces sp. Protein (PhiD) wurde als Außengruppe verwendet. Alle Ausrichtungen wurden mit MUSCLE durchgeführt, das unter MEGA 1131 implementiert wurde. Die Ausrichtung wurde in MEGA 11 modellgetestet und die Maximum-Likelihood-Methode mit WAG-Modell wurde ausgewählt. Messungen der Bootstrap-Unterstützung für interne Zweige wurden aus 1000 Pseudoreplikaten ermittelt.

Genomische DNA wurde aus 1 ml einer Übernachtkultur von C. vaccini DSM 25150T extrahiert, wie zuvor von32 beschrieben. Der mutmaßliche phlACB-Cluster (~ 2,8 KB) wurde aus genomischer DNA von C. vaccini DSM 25150T unter Verwendung der Primer Cluster F (ATG AAG AAG GCA GGC ATA GTG AGC TAT GGC AG) und Cluster R (ATC TTC CAG CAC GAA CTT GTA GGC GTA) amplifiziert TTG CCA) unter Verwendung der Invitrogen Platinum SuperFi II DNA-Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das gelgereinigte PCR-Produkt wurde mit neuen Primern, die die Restriktionsstellen Nco I (5′-Ende) und Hind III (3′-Ende) enthielten, zur Klonierung in den pET28b-Expressionsvektor erneut amplifiziert. Nach der Ligation wurden drei unabhängige Expressionsklone mit dem phlACB-Cluster aus Plasmiden identifiziert, die in E. coli DH 5α transformiert worden waren. Die korrekte Sequenz des amplifizierten phlACB-Clusters in jedem Klon wurde durch Vergleich mit der Genomsequenz von C. vaccini CR1 nach Sequenzierung jedes Klons mit einem MiSeq-DNA-Sequenziergerät verifiziert. Die Plasmidklone phlACB.1, phlACB.3 und phlACB.5 sowie der leere Vektor pET28b wurden einzeln in BL21 E. coli transformiert.

Jede E. coli BL21 phlACB-Zelllinie sowie die Kontroll-BL21-Zellen mit pET28b wurden über Nacht in LB-Brühe mit Kanamycin (50 µg/ml) gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde dann verwendet, um M9-Minimalmedium (200 µl Inokulum in 10 ml Medium) mit Kanamycin (50 µg/ml) zu beimpfen und bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min) wachsen zu lassen, bis die OD 600 0,6 erreichte. Anschließend erhielt jede Kultur 1 mg DAPG (gelöst in Ethanol, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) und Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für eine Endkonzentration von 0,2 mM und inkubierte Aliquots bei 30 °C der Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bei 4 °C gelagert.

Für jeden Zeitpunkt (1, 2, 3, 4 und 7 Tage) und jede Medienbedingung (LB oder KMB) wurden 5 μl Chromobacterium-Kulturmedium mittels LC-MS unter Verwendung eines Vanquish HPLC, ausgestattet mit einer ODS-18-Säule, analysiert (3 mm × 150 mm, 3 μm Partikelgröße, Inertsil, GL Sciences, Inc., Torrance, CA) Die Elution der Analyten erfolgte durch einen linearen Gradienten aus 5:95–95:5 % 18 MΩ-Wasser + 0,1 % Ameisensäure : Optima-Methanol + 0,1 % Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 0,550 ml/min über 30 min bei 50 °C. Der Säulenausfluss wurde durch UV bei Wellenlängen von 254 nm, 280 nm und 270 nm überwacht, bevor er in ein Orbitrap ID-X-Tribrid-Massenspektrometer (ThermoElectron, West Palm Beach, CA) unter Xcalibur 4.4-Steuerung eingeführt wurde. Massenspektraldaten von 200 bis 2000 Da m/z wurden in der Orbitrap mit einer Auflösung von 120.000 gesammelt. Tandem-Massenspektraldaten von Zielmetaboliten wurden mithilfe der Kollisionsdissoziation bei höherer Energie (HCD, CE = 25 und 35) im Orbitrap-Analysator gesammelt.

Aliquots von E. coli-Medien zu den Zeitpunkten 8, 20,5, 28,5, 48 und 68 Stunden von drei Transformanten (pET28-phlACB-1, -3, -5) und einer Nur-Plasmid-Kontrolle (pET28) wurden bei 10.000 U/min zentrifugiert 10 Minuten. Eine Probe des Überstands (250 μl) wurde entnommen und mit 250 μl 18 MΩ-Wasser verdünnt. Ein Teil dieser Verdünnung (5 μl) wurde mittels LC-MS unter denselben oben aufgeführten LC-Bedingungen analysiert, wobei die einzige Änderung an den massenspektrometrischen Analysen darin bestand, die Detektionsmasse auf 100–1000 Da m/z zu senken, um dies zu berücksichtigen der Nachweis von Phloroglucinol und MAPG. Authentische Standards für DAPG und Phloroglucinol (Acros Organics, Geel, Belgien) wurden bei 100 μg/ml analysiert, um Retentionszeiten und MS2-Fragmentierungsmuster der erwarteten Produkte zu ermitteln. Basierend auf den Herstellerangaben beträgt die Nachweisgrenze dieser Analyten unter diesen Bedingungen etwa 100 pg/ml.

Die Chromobacterium vaccinii-Stämme CR1 und CR5 wurden ursprünglich aus Gewässern im brasilianischen Bundesstaat Goiás isoliert26. Der Typstamm von C. vaccini DSM 25150T wurde ebenfalls in die Analyse einbezogen33. Tabelle 1 zeigt, dass bei allen drei Stämmen fünf Cluster gefunden wurden. Die antiSMASH-Software konnte lediglich die Funktion des Violaceins und der potenziellen DAPG-Cluster zuordnen. Ein großer 68,4 kb großer trans-AT-PKS-Cluster wurde mithilfe der BLAST-Software als biosynthetischer Cluster des zyklischen Depsipeptids FR90035934 identifiziert. Die letzten beiden kleinen Cluster (6,9 und 8,6 kb) besitzen Domänen, die darauf hindeuten, dass es sich wahrscheinlich um Siderophore handelt.

Die erste Entdeckung des potenziellen DAPG-Biosyntheseclusters in Genomen ausgewählter C. vaccinii-Stämme veranlasste die Erforschung der Verteilung dieses Clusters in der Gattung Chromobacterium angesichts der historischen Bedeutung dieses Moleküls, das normalerweise in Pseudomonas spp. vorkommt. Stämme12. Nach einer umfassenderen Untersuchung aller verfügbaren Chromobacterium-Genome wurde der Cluster in 11 Genomen der Gattung identifiziert, die in drei Hauptgruppen vorkam (Abb. 1). Die Ergebnisse zeigen, dass der Cluster in allen C. vaccinii-Genomen und einem eng verwandten Chromobacterium piscinae-Stamm gefunden wurde. Eine zweite Klade, die den Cluster enthielt, wurde in Chromobacterium sphagni identifiziert. Die dritte Gruppe bestand aus Chromobacterium amazonense und einer eng verwandten, kürzlich beschriebenen neuen Art von Chromobacterium sinusclupearum35. Der Cluster hatte eine breite geografische Verteilung mit sieben Stämmen aus den Vereinigten Staaten36,37,38, zwei aus Brasilien26, einem aus China (CP022344) und einem aus Malayasien39.

Verteilung der biosynthetischen Cluster von DAPG und Depsipeptid FR900359 in der Gattung Chromobacterium. Die Phylogenie basiert auf dem Kerngenom der in der Abbildung aufgeführten Stämme. Messungen der Bootstrap-Unterstützung für interne Zweige wurden aus 1000 Pseudoreplikaten ermittelt. Aquitalea magnusonii DSM 23134T wurde als Außengruppe verwendet und nicht gezeigt.

Alle biosynthetischen Gene des DAPG-Clusters (phlACBDE) wurden in allen Chromobacterium-Stämmen gefunden, von denen berichtet wurde, dass sie den Cluster enthalten. Interessanterweise enthalten die Chromobacterium-Stämme nicht alle regulatorischen Gene, die mit diesem Cluster in Pseudomonas-Stämmen verbunden sind. Typischerweise enthält der DAPG-Cluster in Pseudomonas-Stämmen die Gene phlF, phlG und phlH, von denen bekannt ist, dass sie die Expression des Clusters regulieren12. Die Chromobacterium-Stämme enthalten nur das phlF-Gen und ihnen fehlen die phlG- und phlH-Gene, was darauf hindeutet, dass sie einen anderen Regulierungsmechanismus nutzen als Pseudomonas-Stämme.

Darüber hinaus war der Biosynthesecluster für das Depsipeptid FR900359 auch auf das Genom von C. vaccinii und einen sehr eng verwandten Stamm, C. piscinae XC0014, beschränkt. Der Violacein-Biosynthesecluster wurde in allen Genomen in Abb. 1 gefunden, mit Ausnahme der beiden Genomen von Chromobacterium phragmitis.

Um den möglichen Ursprung auf dem Cluster zu verstehen, wurde eine Phylogenie des Polyketidsynthase-Proteins PhlD erstellt, das für den DAPG-Cluster von grundlegender Bedeutung ist. Abbildung 2 zeigt, dass der Cluster eng mit Stämmen der Pseudomonas fluorescens-Gruppe verwandt war40. Die durchschnittliche Aminosäureidentität zwischen den Proteomen von C. vaccinii CR1 und dem nächstgelegenen Pseudomonas-Proteom betrug 47 %, während die durchschnittliche Aminosäureidentität zwischen zwei DAPG-Clustern 80 % betrug. In allen Chromobacterium-Genomen, die den Cluster enthielten, befand sich der Cluster in derselben physischen Region des Genoms und teilte dieselben flankierenden Regionen. Bei einer Untersuchung von Chromobacterium-Genomen, denen der Cluster fehlt, wurden an dieser Insertionsstelle keine alternativen Gene oder Cluster gefunden.

Maximum-Likelihood-Phylogenie des PhlD-Proteins aus dem DAPG-Biosynthesecluster. Messungen der Bootstrap-Unterstützung für interne Zweige wurden aus 1000 Pseudoreplikaten ermittelt.

Um die Zuordnung und Aktivität der Biosynthesecluster zu bestätigen, wurde LC-MS/MS verwendet, um das Vorhandensein der Metaboliten in der Kultur zu bestätigen. Die drei zugeordneten Biosynthesecluster waren Violacein, Depsipeptid FR900359 und DAPG. Abbildung 3 zeigt die Bestätigung der Zuordnung von Violacein und Depsipeptid FR900359 mittels hochpräziser Massenspektrometrie. Bei allen drei Stämmen war das Violacein-Signal stark und das Depsipeptid FR900359 viel schwächer. In den Stämmen wurde ein sehr schwaches Signal für DAPG beobachtet, was mit der Retentionszeit und der Massenspektrometrie eines DAPG-Referenzstandards übereinstimmte. Basierend auf den Ergebnissen wurde angenommen, dass der DAPG-Cluster unter diesen Kulturbedingungen aktiv, aber nicht stark exprimiert war. Wir haben die DAPG-Produktion unter verschiedenen Kulturbedingungen (71 verschiedene Kohlenstoffquellen unter Verwendung von Biolog-Platten) bewertet, um festzustellen, ob wir die Expression der DAPG-Aktivität verbessern können. Unter allen getesteten Wachstumsbedingungen verbesserte keine der Bedingungen die Produktion von DAPG signifikant.

LC-MS-Daten von Chromobacterium vaccinii CR1. (A) Extrahierte Ionenchromatogramme von Violacein (schwarz-m/z 344,1–344,2 Da); und Depsipeptid FR900359 (braun – m/z 1002,5–1002,6 Da); (B) Massenspektrum von Violacein; (C) Tandem-Massenspektrum von Violacein; (D) Massenspektrum von FR900359; (E) Tandem-Massenspektrum von FR900359.

Um die Aktivität des Chromobacterium phlACB-Genclusters im Metabolismus von DAPG zu bestätigen, wurde der Cluster in E. coli transformiert. Es ist zu beachten, dass die Expression der phlACB-Gene von Pseudomonas fluorescens in E. coli zur Umwandlung von Phloroglucinol in 2-Acetylphloroglucinol (MAPG, 20 %) und 3 % DAPG im Kulturmedium führte2. Erste Tests mit E. coli, die phlACB aus Chromobacterium exprimierten, ergaben kein DAPG aus Phloroglucinol. Achkar et al. fanden außerdem heraus, dass die Inkubation des E. coli-Transformanten mit DAPG innerhalb von 48 Stunden zu einer vollständigen Umwandlung von DAPG in MAPG (9 %) und Phloroglucinol (22 %) führte. Dies motivierte uns, die Aktivität von phlACB in Richtung DAPG zu Phloroglucinol zu etablieren. Daher wurden Kulturen in 100 μg/ml DAPG gezüchtet, um die Aktivität der Umwandlung von DAPG in MAPG und Phloroglucinol zu bestimmen. DAPG-Biotransformationsproben aus dreifachen Transformationen wurden mittels LC-UV-MS/MS analysiert, um die Identität der Produkte zu bestätigen (Abb. 4). Proben im Verlauf der Inkubationszeit wurden durch UV bei 270 nm (oberes Feld von Abb. 4A–D), der maximalen Absorption für DAPG, überwacht. Das UV-Signal und das extrahierte Ionenchromatogramm von DAPG blieben für die Kontrollreaktion, bei der nur Plasmid-E. coli der Biokatalysator war, über 48 Stunden konstant (Abb. 4A, C). E. coli, das phlACB exprimiert, zeigte im Verlauf von 48 Stunden eine Abnahme des UV- und EIC-Signals für DAPG, während es ein erhöhtes Signal für MAPG aufwies (14,30 Minuten, bestimmt durch UV und genaue Masse, < 1 ppm Fehler, aufgrund des Fehlens von). authentischer Standard) und Phloroglucinol (nach 48 Stunden, 2,92 Minuten, basierend auf genauer Masse und Vergleich mit authentischem Standard). Bei längeren Reaktionszeiten mit E. coli, das phlACB exprimierte, nahmen die DAPG- und MAPG-Signale ab und es traten zusätzliche UV-Peaks auf.

LC-UV-MS-Daten von Kontroll- und transformierten E. coli, inkubiert mit 100 μg/ml DAPG. Das Kulturmedium wurde vor der Analyse 1:1 mit 18 MΩ Wasser verdünnt. Schwarz-UV bei 270 nm (λmax für DAPG); Braun-extrahiertes Ionenchromatogramm von 211,05 bis 211,07 m/z; grün-extrahiertes Ionenchromatogramm von 169,00 bis 169,20 m/z; blau-extrahiertes Ionenchromatogramm von 127,03 bis 127,05 m/z. DAPG bei 24,3 Min., MAPG bei 14,3 Min., Phloroglucinol bei 2,9 Min. (A) 8-Stunden-Kontrolle. (B) 8 h phlACB. (C) 48-Stunden-Kontrolle. (D) 48 h phlACB. E. Strukturen, Massen und Weg des DAPG-Abbaus.

DAPG ist seit 40 Jahren ein wichtiges Molekül in der Bioaktivität der Rhizosphäre, die Pseudomonas-Arten besiedelt, und Gegenstand umfangreicher Untersuchungen12. Aus diesem Grund fanden wir es interessant zu entdecken, dass aus Gewässern isolierte Stämme von C. vaccinii den DAPG-Cluster aufweisen26. Der Typstamm von C. vaccinii und andere repräsentative Isolate von C. vaccinii wurden ursprünglich aus der Rhizosphäre und Wasserumgebungen isoliert, die mit einheimischen und kultivierten Preiselbeeren (Vaccinium Macrocarpon Ait.) assoziiert sind33. Dieser Zufall legt nahe, dass DAPG bei Chromobacterium eine ähnliche ökologische Funktion erfüllen könnte wie bei Pseudomonas-Arten. Bei Pseudomonas-Arten ist seit langem bekannt, dass DAPG Phytopathogene und andere Mikroben in der Rhizosphäre unterdrückt41. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DAPG-haltige Pseudomonas-Stämme eine Schlüsselkomponente von krankheitsunterdrückenden Böden bei der Bekämpfung der Weizenwurzelkrankheit „Take-All Declan“ sind5. Es ist möglich, dass DAPG in Chromobacterium eine ähnliche ökologische Rolle für Pflanzen in Mooren oder ähnlichen Gewässern spielt. Es ist auch bemerkenswert, dass diese Gattungen nur entfernt miteinander verwandt sind und die engste gemeinsame Gruppe auf der Ebene des Stammes (Proteobacteria) liegt, wobei Chromobacterium zur Klasse Betaproteobacteria und Pseudomonas zur Klasse Gammaproteobacteria gehört.

Die Verbreitung des DAPG-Biosyntheseclusters in der Gattung Chromobacterium ist auf einige wenige verschiedene Kladen beschränkt. Es ist interessant, dass alle Mitglieder von C. vaccinii, C. sphagni und C. sinusclupearum diesen Cluster aufweisen (Abb. 1). Diese Arten weisen jedoch eine begrenzte Genomrepräsentation auf, da jeweils 5, 2 bzw. 2 ganze Genome sequenziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass ein Selektionsdruck besteht, um den Cluster in der Art aufrechtzuerhalten, insbesondere bei C. vaccinii, wo alle Stämme aus unterschiedlichen Umgebungen stammen. Die Analyse zeigt auch, dass der DAPG-Cluster eine breite geografische Verbreitung mit Genomen aus Nordamerika, Südamerika und Asien aufweist. Zusätzlich zum DAPG-Cluster haben wir zwei weitere Biosynthesecluster in den interessierenden Genomen identifiziert: Depsipeptid FR900359 und Violacein. Am auffälligsten war, dass Depsipeptid FR900359 zusammen mit DAPG in den C. vaccinii-Stämmen auftrat, während Violacein in allen Chromobacterium-Genomen mit Ausnahme der beiden C. phragmitis-Genomen auftrat. Es ist nicht klar, ob DAPG und Depsipeptid FR900359 eine Anpassung an ein bestimmtes ökologisches Bedürfnis darstellen oder ob ihre Korrelation ein Zufall ist.

Es wurde festgestellt, dass das Depsipeptid FR900359 ein starker und selektiver Inhibitor von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) bei Menschen und anderen Säugetieren ist42,43. GPCRs sind wichtige Elemente für die intrazelluläre Signaltransduktion, die auf die Bindung externer Liganden und erste Reaktionskaskaden durch Guanosintriphosphat- und Guanosindiphosphat-Austausch reagieren44. Heute sind Depsipeptid FR900359 und eng verwandte Verbindungen, zusammenfassend als Chromodepsine bekannt, wichtige pharmakologische Hilfsmittel zur Verwendung als Therapeutika und Hilfsmittel zur Untersuchung der GPCR-Funktion45. Interessanterweise wurden Chromodespins ursprünglich aus einer Pflanze (Ardisia crenata) isoliert, die in der traditionellen Medizin verwendet wird46. Später stellte sich heraus, dass die Verbindung tatsächlich von einem endosymbiotischen Bakterium der Gattung Burkholderia47 produziert wurde. Die ökologische Rolle dieser Verbindung ist nicht genau geklärt. Chromodespins zeigen einen Mangel an Hemmung gegenüber pflanzlichen GPCRs43. Es wurde vermutet, dass sie ihrer Wirtspflanze einen Nutzen bieten könnten, indem sie als Abschreckung gegen Pflanzenfresser wirken47. Interessanterweise wurde gezeigt, dass Chromodespins eine insektizide Wirkung gegen die Bohnenwanze (Riptortus pedestris) haben und die GPCRs der Schädlinge Weiße Fliege (Bemisia tabaci) und Seidenspinner (Bombyx mori) hemmen45. Dies legt nahe, dass Stämme von C. vacinnii auch bei der Bekämpfung von Insektenschädlingen nützlich sein könnten.

Alle Chromobacterium-Genome mit Ausnahme der beiden C. phragmitis-Genome enthielten die violett pigmentierte Verbindung Violacein. Es wurde berichtet, dass Violacein eine Reihe bioaktiver Eigenschaften besitzt. Es hat sich gezeigt, dass es antimykotische Eigenschaften gegen eine Vielzahl von phytopathogenen und menschlichen Pilzpathogenen hat48. Es wurde berichtet, dass es antibakterielle Wirkungen49 und antinematizide Wirkungen50 hat. Die Verbindung zeigte fraßhemmende, larvizide und pupicizide Wirkung gegen den Asiatischen Heerwurm (Spodoptera litura Fab.)51. Diese breit angelegten Bioaktivitäten legen nahe, dass Violacein möglicherweise auch zum Biokontrollpotenzial dieser Chromobacterium-Stämme beiträgt.

Die Phylogenie des PhlD-Proteins (Abb. 2) legt nahe, dass alle DAPG-Cluster in Chromobacterium einen gemeinsamen Vorfahren haben und der nächste Nicht-Chromobacterium-Vorfahre wahrscheinlich aus der Pseudomonas flurescens-Gruppe stammt. Aus dem phylogenetischen Stammbaum ist es schwierig, definitiv abzuleiten, ob der Cluster ein Transferereignis in Chromobacterium hatte und einige Nachkommenlinien den Biosynthesecluster verloren haben oder ob andere horizontale Gentransferereignisse (HGT) innerhalb der Chromobacterium-Gattung aufgetreten sind (z. B. ein HGT von C. vaccinii). zu C. sinusclupearum).

In Wildtyp-C. vaccinii-Isolaten konnte die Produktion von DAPG nur in Spuren nachgewiesen werden. Bemühungen, die Produktion von DAPG durch das Screening verschiedener Medienbedingungen und Kohlenstoffquellen zu steigern, waren erfolglos. Es ist möglich, dass Moleküle in aquatischen Umgebungen die Biosynthese von DAPG in Chromobacterium induzieren. Dennoch haben wir bestätigt, dass die biosynthetischen Gene im Chromobacterium für die DAPG-Produktion intakt und funktionsfähig waren. Unsere Ergebnisse legen auch nahe, dass sich der Regulierungsmechanismus von Chromobacterium-Stämmen erheblich von dem von Pseudomonas-Stämmen unterscheidet, da ihnen die bekannten Regulierungsgene phlG und phlH12 fehlen. Darüber hinaus fehlen ihnen die posttranslationalen Pseudomonas-Regulationsgene rsmA und rsmE (Daten nicht gezeigt)12. In Zukunft müssen weitere Experimente durchgeführt werden, um den Regulierungsmechanismus der DAPG-Produktion in Chromobacterium zu entdecken. Wir gingen davon aus, dass die mangelnde Aktivität auf die mangelnde Expression dieser Gene zurückzuführen war. Wir haben den phlACB-Cluster in E. coli übertragen, um die Expression dieser Gene direkt kontrollieren zu können. Bei ersten Tests des Transformanten gelang es nicht, DAPG aus Phloroglucinol herzustellen. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, dass die Expression des phlACB-Clusters in E. coli keine oder nur Spuren von DAPG2,52 produzierte. In früheren Studien war jedoch die Rückreaktion, die Umwandlung von DAPG in MAPG und Phloroglucinol, aktiv2,52. Die Überwachung der Rückreaktion zeigte eine zeitabhängige Abnahme der im Medium vorhandenen DAPG-Menge, wenn phlACB exprimiert wurde. Es gab einen Anstieg der UV270 nm bei Retentionszeiten, die der genauen Masse von MAPG und Phloroglucinol entsprachen (Abb. 4E), was zeigt, dass der Cluster DAPG in MAPG und Phloroglucinol umwandeln konnte. Es ist zu beachten, dass bei Experimenten, bei denen E. coli-exprimierende phlACB-Transformanten mit Phloroglucinol inkubiert wurden, um DAPG zu produzieren, das verwendete Phloroglucin eine kleine DAPG-Verunreinigung (< 1 %) enthielt. Bei der Inkubation mit den E. coli-exprimierenden phlACB-Transformanten wurde diese DAPG-Verunreinigung in Phloroglucinol umgewandelt und es wurde keine Reaktion in Richtung der DAPG-Bildung beobachtet. Es ist nicht bekannt, warum phlACB-Transformanten die Produktion von Phloroglucinol begünstigten und die Biotransformation zu DAPG nicht stattfand. Allerdings haben Liu et al.52 kürzlich eine erhöhte Produktion von DAPG in E. coli gezeigt, die phlACB-Transformanten exprimieren, und zwar durch die Koexpression der Gene acc, marA und phlE.

Eine Literaturrecherche ergab einige Beispiele von Chromobacterium-Stämmen, die als potenzielle Biokontrollmittel zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen bewertet wurden22,23,24,25. Zwei der Studien verwenden Chromobacterium haemolyticum C-61, das starke antimykotische Aktivitäten gegen mehrere Pflanzenpathogene zeigte23,24. Diese Studien identifizierten ein weiteres neues zyklisches Lipopeptid, das sie Chromobactomycin nannten und das für die beobachtete Aktivität verantwortlich war24. Das Genom ist für diesen Stamm verfügbar und enthält nicht den DAPG-Cluster. Han et al. identifiziertes Chromobacterium sp. JH7 während eines Screening-Tests zur Identifizierung von Antagonisten von Cylindrocarpon destructans, einem Wurzelfäule-Erreger von Ginseng22,23,24,25. Den Autoren gelang es nicht, den Stamm auf Artebene zu identifizieren. Es ist möglich, dass DAPG oder Depsipeptid FR900359 mit dieser Aktivität in Zusammenhang stehen, es liegen jedoch derzeit keine Daten vor, die diese Spekulation stützen. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde gezeigt, dass C. vaccinii mehrere pilzliche Pflanzenpathogene durch die Emission bioaktiver flüchtiger Stoffe hemmt22,23,24,25. Wir konnten keine gemeldete DAPG-Aktivität in Chromobacterium sp. finden. in der Literatur.

Unsere Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein und die Aktivität des DAPG-Biosyntheseclusters in der Gattung Chromobacterium. Diese Ergebnisse und die begrenzten Untersuchungen der Biokontrollaktivität gegen Pflanzenpathogene durch die Gattung Chromobacterium legen nahe, dass weitere Forschung in diesem Bereich gerechtfertigt ist.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Alle von unserem Labor generierten Sequenzdaten sind unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA782632 verfügbar.

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Die Autoren danken Madeleine Adolf, Mark Doering und Heather Walker für die fachkundige technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise vom US-Landwirtschaftsministerium, Agricultural Research Service, unterstützt (Projektnummer: 5010-22410-024-00-D). Alle in dieser Veröffentlichung geäußerten Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Meinung des US-Landwirtschaftsministeriums wider. Die Erwähnung von Firmennamen oder Handelsprodukten bedeutet nicht, dass diese vom USDA gegenüber anderen Firmen oder ähnlichen, nicht erwähnten Produkten empfohlen oder empfohlen werden. USDA ist ein Anbieter und Arbeitgeber für Chancengleichheit.

Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, Agrarforschungsdienst, National Center for Agricultural Utilization Research, Crop Bioprotection Research Unit, 1815 North University St, Peoria, IL, 61604, USA

Eric T. Johnson und Christopher A. Dunlap

Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, Agricultural Research Service, National Center for Agricultural Utilization Research, Bioenergy Research Unit, 1815 North University St, Peoria, IL, 61604, USA

Michael J. Bowman

Institut für Tropenpathologie und öffentliche Gesundheit, Bundesuniversität Goiás, Goiânia, Goiás, Brasilien

Raylane Pereira Gomes & Lilian Carla Carneiro

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Alle aufgeführten Autoren haben wesentliche oder indirekte Beiträge zur Arbeit und zur Versuchsplanung geleistet. RPG sammelte die Proben und Daten. MB, CD führten die Metabolomik durch und analysierten die Daten und EJ führte die molekularbiologischen Experimente durch, CD führte die vergleichende Genomik und Phylogenie durch und verfasste das Manuskript. CD, MB, EJ, RPG und LCC haben den Artikel gelesen und das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit Christopher A. Dunlap.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Johnson, ET, Bowman, MJ, Gomes, RP et al. Identifizierung der 2,4-Diacetylphloroglucinol-Produktion in der Gattung Chromobacterium. Sci Rep 13, 14292 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41277-0

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Eingegangen: 01. März 2023

Angenommen: 24. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41277-0

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