Verwendung einer synthetischen Maschinerie zur Verbesserung der Kohlenstoffausbeute mit Acetylphosphat als Kern

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5286 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In mikrobiellen Zellfabriken verringert die CO2-Freisetzung während der Acetyl-CoA-Produktion aus Pyruvat die Kohlenstoffatomökonomie erheblich. Hier konstruieren und optimieren wir einen synthetischen Kohlenstoff konservierenden Weg namens Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase-Zyklus mit trifunktionaler PhosphoKetolase (SCTPK) in Escherichia coli. Dieser Zyklus basiert auf einer generalistischen Phosphoketolase Xfspk und wandelt Glucose in stöchiometrische Mengen Acetylphosphat (AcP) um. Darüber hinaus werden genetische Schaltkreise geschaffen, die positiv oder negativ auf AcP reagieren. Zusammen mit SCTPK bilden sie einen genmetabolischen Oszillator, der Xfspk und Enzyme reguliert, die AcP als Reaktion auf den intrazellulären AcP-Spiegel autonom in wertvolle Chemikalien umwandeln, den Stoffwechselfluss rational verteilen und die Kohlenstoffatomökonomie des Biokonversionsprozesses verbessern. Mithilfe dieser Synthesemaschinerie wird Mevalonat mit einer Ausbeute hergestellt, die über der ursprünglichen theoretischen Ausbeute liegt, und der höchste Titer und die höchste Ausbeute an 3-Hydroxypropionat werden über den Malonyl-CoA-Weg erreicht. Diese Studie bietet eine Strategie zur Verbesserung der Kohlenstoffausbeute mikrobieller Zellfabriken.

In jüngster Zeit gewinnt die Bioproduktion gewünschter Chemikalien und Materialien aufgrund ihrer Umweltfreundlichkeit und praktischen Durchführbarkeit an Bedeutung. Bei der Gestaltung und Konstruktion mikrobieller Zellfabriken besteht ein zentrales Problem darin, die Flüsse zum gewünschten Produkt zu verbessern und die Kohlenstoffatomökonomie zu maximieren1. Dies ist besonders im Hinblick auf das globale Erreichen des CO2-Höhepunkts und der CO2-Neutralität sehr wichtig. Der Kern jedes Stoffwechselnetzwerks in Mikroorganismen ist ein Rückgrat mit hohem Fluss, das allgemein als Zentralstoffwechsel2 bezeichnet wird und für die Umwandlung primärer Eingangssubstrate in Energie und eine Reihe von Bausteinen für die Produktion zellulärer Polymere verantwortlich ist und als unveränderlich angesehen wird Betriebssystem der Zelle3. Wenn wir also eine synthetische Maschinerie aufbauen wollen, die einen lebenden Organismus in eine wirklich produktive Biofabrik verwandelt, muss ein erfolgreicher biotechnologischer Ansatz neben der Optimierung des Biosynthesewegs als eigenständige Einheit auch das endogene Stoffwechselnetzwerk des Wirts, insbesondere seinen Zentralstoffwechsel, verändern , um den Bioproduktionsprozess zu unterstützen4. In Mikroorganismen ist Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) nicht nur ein grundlegender Metabolit in zentralen Stoffwechselwegen, sondern auch ein Vorläufer für zahlreiche industriell relevante Produkte5,6,7. Die Umgestaltung des zentralen Stoffwechsels des Mikroorganismus, um reichlich Acetyl-CoA mit hoher Kohlenstoffatomökonomie bereitzustellen, wird sich also positiv auf die Bioproduktion einer Vielzahl von Chemikalien und Materialien auswirken.

Um die Acetyl-CoA-Ausbeute zu verbessern, besteht eine typische Strategie in der Eliminierung des Kohlenstoffflusses zu konkurrierenden Signalwegen und der Überexpression wichtiger Enzyme, um eine ausreichende Produktion von Acetyl-CoA8,9 sicherzustellen. Dieser Ansatz ist unkomplizierter und einfacher im Design, erhöht jedoch nicht tatsächlich die theoretische Kohlenstoffausbeute der Zielchemikalie. Natürliche Mikroorganismen wandeln Glucose normalerweise über den Glykolyseweg in Acetyl-CoA um, zusammen mit der Decarboxylierung von Pyruvat durch die Pyruvatdehydrogenase, wobei aus jedem Mol Glucose 2 Mol Acetyl-CoA und 2 Mol CO2 erzeugt werden10. Diese Freisetzung von CO2 führt zu einer erheblichen Verringerung der Atomökonomie des gezielten chemischen Biosynthesewegs und stellt den größten Kohlenstoffverlust im mikrobiellen Kohlenstoffstoffwechsel und bei der Bioraffinierung dar11. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein synthetischer Weg der nichtoxidativen Glykolyse (NOG) entwickelt (ergänzende Abbildung 1), der Glucose in stöchiometrische Mengen Acetylphosphat (AcP) umwandelt, das durch Phosphatacetyltransferase weiter zu Acetyl-CoA12 katalysiert wird. Diese NOG-Konfiguration beruht auf der Kohlenstoffumlagerung und Phosphoketolase, die die irreversible Umwandlung von Fructose-6-phosphat (F6P) oder Xylulose-5-phosphat (X5P) in AcP und Erythrose-4-phosphat (E4P) oder Glycerinaldehyd-3-phosphat katalysiert ( GAP).

Basierend auf mathematischen Modellen haben Andersen et al. schlugen eine neue Variante des NOG-Signalwegs mit der Einführung einer neuen Phosphoketolase-Aktivität gegenüber Sedoheptulose-7-phosphat (S7P) vor13. Anschließend haben Hellgren et al. konstruierten die vorgeschlagene NOG-Variante in Saccharomyces cerevisiae14. Die Phosphoketolase aus Bifidobacterium longum, von der gezeigt wurde, dass sie auf S7P, F6P und )-abhängiger Zyklusweg (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). Ähnlich wie beim NOG-Weg wandelt dieser Weg jedes Mol Glucose in 3 Mol AcP um, wobei 1 Mol ATP verbraucht wird, und es gibt keine Nettoproduktion oder einen Nettoverbrauch an Reduktionskraft (Ergänzende Daten 1). Andererseits ist der SBP-abhängige Zyklus der kürzeste Weg zur Kohlenstoffkonservierung und erfordert nur 6 Enzyme, während NOG 8 Enzyme benötigt. Für die Kohlenstoffumlagerung als NOG-Weg sind keine Transaldolase und Transketolase mehr erforderlich, was die Anzahl der beteiligten Enzyme und die Komplexität dieses Weges verringert, der sowohl die Kohlenstoffatomökonomie als auch die Proteinökonomie darstellt. Allerdings handelte es sich bei dieser Studie nur um einen Proof-of-Concept, und manipulierte Hefestämme, die den SBP-abhängigen Zyklus tragen, lieferten immer noch eine geringe Ausbeute an Acetyl-CoA-abgeleiteten Chemikalien aus Glucose14. Neben S. cerevisiae ist auch Escherichia coli ein bevorzugter Wirtsmikroorganismus für die Bioproduktion. In dieser Studie wird dieser SBP-abhängige Zyklus nach seinem charakteristischen Zwischenprodukt und Enzym als SBP-Zyklus mit trifunktionaler Phosphoketolase (SCTPK) benannt und in E. coli evaluiert und optimiert.

a Senkung der CO2-Emissionen durch den Aufbau und die Optimierung eines CO2-Einsparpfads SCTPK. G6P Glucose-6-phosphat, F6P Fructose-6-phosphat, AcP Acetylphosphat, E4P Erythrose-4-phosphat, SBP Sedoheptulose-1,7-bisphosphat, GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat, PfkA 6-Phosphofructokinase I, GapB Erythrose-4 -Phosphat-Dehydrogenase, GapA-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. b Entwicklung eines AcP-zentrierten genmetabolischen Oszillators, der aus einem Aktivierungsmodul und einem Repressionsmodul zur dynamischen Neuzuordnung des Flusses besteht. c Anwendungen der synthetischen Maschinerie in der Biosynthese von Chemikalien und Materialien. Zu den Produkten für den Machbarkeitsnachweis gehören 3-Hydroxypropionat, Mevalonat und Polyhydroxybutyrat.

Der Ausgang der SCTPK ist AcP, das nicht nur ein wichtiger Regulierungsknoten für den zentralen Stoffwechsel ist, sondern auch ein globales Signal, das über posttranslationale Proteinmodifikationen verschiedene zelluläre Prozesse beeinflusst15. AcP kann seine Phosphorylgruppe an Reaktionsregulatoren von Zweikomponenten-Signaltransduktionssystemen abgeben und diese aktivieren16,17 und kann auch Lysinreste acetylieren, um die Struktur, enzymatische Aktivität und Stabilität des entsprechenden Proteins zu modulieren18,19. Um mögliche ungünstige Auswirkungen der AcP-Akkumulation zu vermeiden, ist es wichtig, einen auf AcP reagierenden genetischen Schaltkreis zu entwickeln, um das Expressionsniveau von Genen, die mit der AcP-Produktion und -Nutzung in Zusammenhang stehen, in einem manipulierten Stamm, der SCTPK trägt, raffiniert anzupassen. Das Ntr-System, bestehend aus dem Sensor NRII (glnL-Produkt) und dem Reaktionsregulator NRI (glnG-Produkt), steuert eine Transkriptionsreaktion auf Stickstoffmangel20. Wenn NRII fehlt, kann NRI selbst den AcP-Spiegel erkennen und den glnAp2-Promotor entsprechend aktivieren21. Da das Ntr-System unter den meisten Bioreaktorbedingungen eine vernachlässigbare Rolle spielt, wurde NRII ausgeschaltet und NRI als dynamischer Controller rekrutiert, um die Expression von Lycopin-Biosynthesegenen als Reaktion auf den glykolytischen Flussindikator AcP im manipulierten E. coli-Stamm zu aktivieren verbesserte Lycopinproduktion21. Dies war das erste Beispiel einer dynamischen Kontrolle, die auf der Erkennung eines bestimmten Metaboliten beruhte. Darüber hinaus wurden AcP-zentrierte Oszillatoren mit der Einführung eines AcP-induzierten LacI-Repressors entwickelt, der die Expression von NRI aus dem glnAp2-Promotor22 oder Pta, der Acetyl-CoA in AcP23 umwandelt, blockieren würde. Daher sind NRI-basierte genetische Schaltkreise mit geeigneten Eigenschaften in der Lage, die Expression verwandter Gene als Reaktion auf den AcP-Spiegel zu steuern und dabei zu helfen, die intrazelluläre AcP-Homöostase aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus hat sich die dynamische Steuerung des Stoffwechselflusses, die auf der Reaktion eines Biosensors auf bestimmte Metaboliten beruht, als vielversprechend erwiesen, nicht nur für eine rationelle Zuweisung intrazellulärer Ressourcen, sondern auch für Verbesserungen der Ausbeute und des Titers des Zielprodukts sowie für die Vermeidung von Stoffwechselbelastung und toxischer Anreicherung24.

In dieser Studie konstruieren wir eine Synthesemaschinerie zur Verbesserung der Kohlenstoffausbeute mit AcP als Kern und verwenden E. coli als Wirt (Abb. 1). Erstens wird SCTPK durch Überexpression von Xfspk und SBPase zusammengesetzt und durch Unterdrückung der Expression konkurrierender Enzyme mithilfe von Antisense-RNA-Interferenz (asRNA) verbessert. Zweitens wird eine Reihe genetischer Schaltkreise entwickelt, die durch AcP, das Produkt von SCTPK, aktiviert oder unterdrückt werden und einen genmetabolischen Oszillator bilden, der auf den intrazellulären AcP-Spiegel reagiert. Drittens erhöht die Synthesemaschinerie die Produktion und Ausbeute einiger industriell relevanter Produkte, darunter 3-Hydroxypropionat (3HP), Polyhydroxybutyrat (PHB) und Mevalonat (MVA), wenn sie auf Glukose wachsen.

Die SCTPK verwendet sechs Enzyme und alle Enzyme außer Xfspk und SBPase sind bereits in E. coli vorhanden (Abb. 2a). Für SBPase wurde charakterisiert, dass Shb17 aus S. cerevisiae die spezifische Dephosphorylierung von SBP25 katalysiert, und es wurde berichtet, dass einige Fructose-1,6-biphosphatasen (FBPasen) mit hochkonservierten Lithium-bindenden Domänen promiskuitive Aktivität als SBPase26,27 aufweisen. Daher wurden Gene, die für Shb17 und FBPasen mit diesem Merkmal aus verschiedenen Bakterien kodieren (ergänzende Abbildung 2), im Stamm E. coli BL21 (DE3) synthetisiert und exprimiert, und entsprechende mit einem His6-Tag fusionierte Proteine ​​wurden gereinigt (ergänzende Abbildung 3). . Darüber hinaus wurde auch His6-markiertes FbaA aus E. coli, FBP-Aldolase, das die Kondensation von E4P und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP)28 katalysiert, gereinigt, um das kommerziell nicht erhältliche SBP für den In-vitro-Aktivitätstest von SBPase und Xfspk bereitzustellen. Wie in Abb. 2b gezeigt, ist GlpX aus Synechocystis sp. PCC6803 (SyGlpX) wies die höchste SBPase-Aktivität auf, wahrscheinlich weil die SBPase-Aktivität für den Calvin-Benson-Zyklus zur CO2-Fixierung in Cyanobakterien erforderlich ist29. Als auch die Ergebnisse des FBPase-Assays (ergänzende Abbildung 4) berücksichtigt wurden, wurde SyGlpX ausgewählt, da sowohl SBPase- als auch FBPase-Aktivitäten für den Aufbau des SCTPK erforderlich waren: SBPase liefert die zweite irreversible Antriebskraft dieses Zyklus und FBPase verringert die Glykolyse Flussmittel und drückt den Kohlenstofffluss in das SCTPK. Das Xfspk aus B. longum wurde verwendet, um AcP aus der Aldolspaltungsreaktion von S7P, F6P und X5P herzustellen, und dieses Protein wurde auch durch einen In-vitro-Aktivitätstest gereinigt und validiert (Abb. 2c). Da die Xfspk-Aktivität geringer war als die der SBPase, wird das xfspk-Gen von einem Plasmid mit hoher Kopienzahl getragen, um dessen Expressionsniveau zu erhöhen, und das glpX-Gen von Synechocystis sp. PCC6803 wird in der folgenden Stammkonstruktion unter der Kontrolle eines konstitutiven starken Promotors Pj23119 (ergänzende Abbildung 5) in das E. coli-Genom integriert.

a Konfiguration des ursprünglich erstellten SCTPK. Phosphoketolase und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) wurden überexprimiert, die Gene tktAB, talAB, pflB, ldhA, adhE, poxB und aceE wurden gelöscht. G6P Glucose-6-phosphat, F6P Fructose-6-phosphat, FBP Fructose-1,6-biphosphat, E4P Erythrose-4-phosphat, DHAP Dihydroxyacetonphosphat, S7P Sedoheptulose-7-phosphat, R5P Ribose-5-phosphat, Ru5P Ribulose -5-phosphae, X5P b In-vitro-SBPase-Aktivität von GlpX-Proteinen aus Bacillus methanolicus, Saccharomyces cerevisiae CEN.PK, E. coli BW25113, Serratia marcescens, Synechocystis sp. PCC6803 und Thermosynechococcus elongatus (n = 3 biologisch unabhängige Proben). c Phosphoketolaseaktivität von Xfspk aus Bifidobacterium longum mit X5P, F6P bzw. S7P als Substrat (n = 3 biologisch unabhängige Proben). d In-vivo-Validierung des SCTPK basierend auf der Acetyl-CoA-Verfügbarkeit. Als Kontrolle wurde der Stamm Q3952 (tktAB, talAB, poxB, ldhA, adhE, pflB) verwendet. Die Löschung des aceE-Gens führte zu einem Wachstumsmangel, der durch Zugabe von exogenem Acetat oder Einführung von SCTPK (dem Stamm Q3964, der durch Einführung von Xfspk und GlpX aus Synechocystis sp. PCC6803 in Q3952 aceE erzeugt wurde) ausgeglichen werden konnte (n = 3 biologisch unabhängige Proben). ). e Eine funktionelle SCTPK rettete das Wachstum der E. coli-gnd-Mutante, der die Biosynthese von R5P fehlt (n = 3 biologisch unabhängige Proben). f Die endgültige Zelldichte und spezifische Wachstumsrate von E. coli-Stämmen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die intrazelluläre AcP- (g) und Pyruvat- (h) Konzentration von E. coli BW25113, Stamm Q3952 ΔaceE und Stamm Q3964 (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Fehlerbalken, Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die SCTPK in vivo zusammenzubauen, wurde ein E. coli BW25113-Mutant Q3952 als Ausgangsstamm entwickelt, in dem die für die Kohlenstoffumlagerung verantwortlichen tktAB- und talAB-Gene ausgeschaltet wurden, um die Beeinträchtigung des NOG-Signalwegs und der mit Nebenprodukten verbundenen Gene auszuschließen Acetat, Laktat, Ethanol und Formiat (poxB, ldhA, adhE, pflB) wurden gelöscht, um Kohlenstoffverluste zu vermeiden (Abb. 2a). Darüber hinaus wurde die Acetyl-CoA-Produktion aus der Pyruvat-Decarboxylierung durch die Deletion des aceE-Gens blockiert, was zu einem Wachstumsdefizit sowohl im modifizierten M9-Medium mit 1 g/L Hefeextrakt als auch im LB-Medium führte, das durch Zugabe von exogenem Kaliumacetat ausgeglichen werden konnte (Abb . 2d und ergänzende Abb. 6). Im Gegensatz dazu erholte sich der Stamm Q3964, der durch Einführung von Xfspk und SyGlpX in Q3952 ΔaceE erzeugt wurde, von der Wachstumsunfähigkeit (Abb. 2d, f), was zeigt, dass der Acetyl-CoA-Pool durch das konstruierte SCTPK wieder aufgefüllt wurde. Darüber hinaus wurde das gnd-Gen gelöscht, was zu einer Erschöpfung von Ribose-5-phosphat (R5P), dem Vorläufer für Nukleotide und Histidinsynthese, in einem Stamm führen sollte, dem die Kohlenstoffumlagerung fehlt. Allerdings wuchs die gnd-Mutante ebenso gut wie ihr Elternstamm, was darauf hindeutet, dass R5P als Zwischenprodukt der SCTPK erzeugt werden könnte, was durch die Tatsache bestätigt wird, dass eine gnd-Mutante mit unvollständiger SCTPK selbst in Gegenwart von Kaliumacetat nicht wachsen konnte ( Abb. 2e, f). Alle diese Ergebnisse zeigten, dass die SCTPK in vivo gut funktioniert und Acetyl-CoA auf eine Weise erzeugen kann, die den Kohlenstofffreisetzungsprozess von Pyruvat zu Acetyl-CoA umgeht.

Der Metabolitengehalt im Stamm, der die SCTPK integriert, wurde anschließend getestet und zeigte, dass die AcP-Konzentration 1,79-fach höher ist als die im Wildtyp-Stamm (Abb. 2g), was darauf hinweist, dass unsere technische Strategie die AcP-Produktion tatsächlich erhöht. Im Stamm Q3952 aceE war die intrazelluläre Pyruvatkonzentration 2,34-fach höher als die des Wildtyp-Stamms und wurde durch die Überexpression von Xfspk und SyGlpX signifikant verringert, blieb aber höher als beim Wildstamm (Abb. 2h). Dies deutet darauf hin, dass eine weitere Optimierung erforderlich ist, um den Kohlenstofffluss in das SCTPK zu ziehen und so die Kohlenstoffausbeute zu erhöhen.

Bei dem Stamm mit der SCTPK wurde festgestellt, dass einige Enzyme diesen Weg umleiten und daher Kohlenstoffverluste verursachen können (Abb. 3a). Unter ihnen katalysiert PfkA die Reaktionen von F6P zu FBP und S7P zu SBP, die beide Umkehrreaktionen von SBPase sind; GapA ermöglicht die Produktion von Glycerat-1,3-bisphosphat (BPG), das in die Glykolyse eingeht, um Pyruvat zu produzieren; GapB wandelt E4P in 4-Phospho-d-Erythronat (4PE) um, einen Inhibitor der R5P-Isomerase (Rpi)30, die an der SCTPK beteiligt ist. Daher war geplant, die Expression dieser Gene durch asRNA-Interferenz zu unterdrücken.

a Gene, die die SCTPK umleiten können und durch Antisense-RNA-Interferenz (asRNA) unterdrückt werden. b Die Hemmeffizienz von asRNA mit gepaarten Termini wurde durch die Länge und das Transkriptionsniveau der asRNA beeinflusst. Die Zahlen unter den Promotoren stellen die relativen Stärken der entsprechenden Promotoren dar, die unter Verwendung von GFP als Reporter bestimmt und in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt sind. c Die intrazelluläre AcP-Konzentration von E. coli BW25113, Q3964, das die SCTPK beherbergt, und drei von Q3964 abgeleiteten Stämmen Dabei wurde die Transkription von GapA, GapB und pfkA unter Verwendung einer 100-nt-asRNA, die von einem Promotor Pj23119 transkribiert wurde, stark unterdrückt (n = 3 biologisch unabhängige Proben). d Die endgültige Zelldichte und spezifische Wachstumsrate von E. coli-Stämmen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). e Relativer mRNA-Spiegel von GapA, GapB und PfkA in Stämmen mit und ohne entsprechende asRNA, bestimmt durch qRT-PCR (n = 3 biologisch unabhängige Proben mit zwei technischen Wiederholungen). f Wirkung der kombinatorischen und hierarchischen Unterdrückung von GapA, GapB und pfkA auf die intrazelluläre Ebene von AcP (n = 3 biologisch unabhängige Proben). g Die endgültige Zelldichte und spezifische Wachstumsrate von E. coli-Stämmen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). h CO2-Emissionsrate der Stämme E. coli BW25113 und Q4531 mit optimiertem SCTPK (n = 2 biologisch unabhängige Proben). i Relative CO2-Emission von BW25113 und Q4531 (n = 2 biologisch unabhängige Proben). j Die intrazelluläre Pyruvatkonzentration von E. coli BW25113, Q3964 und Q4531 (n = 6 biologisch unabhängige Proben). k Acetatakkumulation in Kulturen von E. coli BW25113 und Q4531 (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Fehlerbalken, Mittelwert ± SD. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie bereits berichtet 31, könnte eine doppelsträngige Stammstruktur, die mit invertierten Wiederholungen an der Seite der asRNA erzeugt wird, die Sekundärstruktur der asRNA stabilisieren und die Effizienz und Dauer der Gen-Stummschaltung verbessern (ergänzende Abbildung 7a), und unsere Ergebnisse zeigten darüber hinaus, dass die asRNA Länge und Transkriptionsniveau, die von der Promotor- und Genkopienzahl beeinflusst werden, bestimmten synergetisch die Effizienz der asRNA-Stummschaltung (Abb. 3b und ergänzende Abb. 7). Anschließend wurden die Zielgene pfkA, GapA und GapB einzeln mit 100-nt-asRNA, transkribiert durch den starken Promotor Pj23119, gehemmt und der AcP-Gehalt nachgewiesen. Wie in Abb. 3c gezeigt, war die AcP-Konzentration bei Unterdrückung der Expression des pfkA-Gens 2,23-mal bzw. 1,24-mal höher als beim Wildtyp-Stamm und bei Q3964. Allerdings verringerten hochgradige asRNAs, die auf GapA und GapB abzielten, den AcP-Gehalt sowie die endgültige Zelldichte und spezifische Wachstumsrate drastisch (Abb. 3c, d). In Stämmen mit entsprechenden asRNAs war die Transkription von GapA, GapB und pkfA auf 4,9 %, 6,7 % und 27,2 % der Transkription des Kontrollstamms reduziert, der nur einen doppelsträngigen Stamm, aber keine asRNA-Sequenz aufwies (Abb. 3e). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine starke Unterdrückung der Expression von GapA und GapB das Zellwachstum wahrscheinlich aufgrund ihrer unersetzlichen Rolle bei der Glykolyse und der Vitamin-B6-Synthese stark beeinträchtigte (ergänzende Abbildung 8).

Anschließend wurden kombinatorisch regulierte Stämme mit stark inhibiertem pfkA und mäßiger oder schwacher Repression von GapB (80-nt-asRNA mit Pj23119- bzw. Pj23118-Promotor) konstruiert (ergänzende Abbildungen 9 und 10), und der phänotypische Nachweis zeigte, dass die schwache Repression des GapB-Gens zunahm Die intrazelluläre AcP-Konzentration war 2,45-mal höher als die des Wildtyp-Stammes, obwohl die endgültige Zelldichte und Wachstumsrate leicht verringert war (Abb. 3f, g). Dann wurden Module eingeführt, die eine moderate oder schwache Repression von GapA vermitteln, und eine moderate Repression des GapA-Gens erhöhte die AcP-Konzentration auf den höchsten Wert, der 2,83-mal höher war als der des Wildtyp-Stammes und hatte keinen dramatischen Einfluss auf das Zellwachstum (Abb. 3f, g). Dieser Stamm mit stark unterdrücktem pfkA, mäßig unterdrücktem GapA und schwach unterdrücktem GapB war der beste unter allen konstruierten Stämmen und wurde als Q4531 bezeichnet. Im Vergleich dazu zeigte ein Stamm, bei dem alle drei Gene mäßig unterdrückt waren, eine etwas schwächere Leistung sowohl bei der AcP-Produktion als auch beim Zellwachstum, was darauf hindeutet, dass ein hierarchisches Regulierungssystem für verschiedene Gene dazu beiträgt, die Kohlenstoffausbeute der SCTPK zu verbessern.

Anschließend wurde die CO2-Freisetzung aus den Wildtyp-E. coli-Stämmen BW25113 und Q4531 bestimmt. Die CO2-Freisetzungsrate erfuhr im Laufe des Kultivierungsprozesses erhebliche Veränderungen, und der Stamm Q4531 wies eine maximale CO2-Emissionsrate von 4,20 ml/h auf, weniger als ein Drittel derjenigen des Stammes BW25113 (Abb. 3h). Die gesamte CO2-Freisetzung des Q4531-Stamms verringerte sich im Vergleich zu Wildtyp-E. coli auf 47,4 % (Abb. 3i). Darüber hinaus zeigte der Stamm Q4531 eine signifikante Abnahme der Pyruvatkonzentration im Vergleich zum Wildtyp-Stamm und Q3964 (Abb. 3j), was darauf hindeutet, dass sich der Stoffwechselfluss nach der Gen-Stummschaltung mit kombinatorischen asRNA-Arrays stärker auf die SCTPK verlagerte. Darüber hinaus zeigte der Stamm Q4531 eine Acetatakkumulationskapazität, die nur 11 % des Wildtyp-Stamms ausmachte (Abb. 3k). Bisher haben kombinatorische asRNA-Arrays die Wirksamkeit des entwickelten SCTPK weiter gesteigert, die Produktion von AcP gesteigert und die Freisetzung von CO2 und die Ansammlung von Nebenprodukten unterdrückt, was zu einer verbesserten Kohlenstoffatomökonomie führte. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die Wiederholungssequenzen zur Bildung gepaarter Termini von asRNAs die genetische Stabilität der entsprechenden Plasmide nicht beeinträchtigten (ergänzende Abbildung 10).

Da das NRI-Protein direkt durch AcP phosphyliert werden kann, wurde es hier verwendet, um AcP zu erkennen und die Genexpression entsprechend zu modulieren. Phosphoryliertes NRI ist in der Lage, an Enhancer-Sequenzen vor dem Promotor glnAp2 zu binden, häufig mit der an glnAp2 zusammengesetzten σ54-RNA-Polymerase zu interagieren und die Transkription zu initiieren32 (Abb. 4a). Darüber hinaus stellen Stellen mit geringer Affinität für NRI-P, die sich zwischen dem Enhancer und dem glnAp2-Promotor befinden, einen Gouverneur dar und begrenzen die maximale Promotoraktivität bei hohen Konzentrationen von NRI-P33.

a Der Regulationsmechanismus des Zweikomponentensystems Ntr auf dem Promotor glnAp2. Der Regulator-NRI (kodiert durch glnG) kann durch die Sensorkinase NRII (kodiert durch glnL) oder AcP phosphoryliert werden, an die Enhancer-Sequenz binden und den glnAp2-Promotor aktivieren. Überschüssiges phosphoryliertes NRI bindet jedoch an den Gouverneur und begrenzt die maximale Promotoraktivität . b Durch Einfügen eines starken Terminators rrnB T1 wurde die selbstaktivierende Feedforward-Schleife von NRI eliminiert. Gene, die für blau und rot fluoreszierende Proteine ​​kodieren, wurden in das E. coli-Chromosom eingefügt, das den glnA-Terminator flankiert, und die Zellen wurden mittels konfokaler Lasermikroskopie beobachtet. Die Maßstabsbalken waren 2 μm groß. Ähnliche Ergebnisse wurden aus drei biologisch unabhängigen Proben erhalten und ein repräsentatives Ergebnis angezeigt. c Modell, das ein abstimmbares UND-Gatter veranschaulicht, das aus AcP und NRI als Eingaben und GFP-Ausdruck als Ausgabe besteht. d Die strukturellen und reaktionsfähigen Eigenschaften von AcP-aktivierten Schaltkreisen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Das pRSF-Plasmid ist ein Derivat von pRSFDuet-1, bei dem das lacI-Gen und der T7-Promotor deletiert wurden. e Dynamikbereich der AcP-aktivierten genetischen Schaltkreise (n = 3 biologisch unabhängige Proben). f Docking-Ansicht der Helix-Turn-Helix (HTH)-Region von E. coli NRI, gebunden an Enhancer. g Simulation der Wechselwirkungen der NRI-HTH-Region von E. coli mit den rechten Halbstellen der drei künstlich gestalteten Enhancer P, N und I. Gestrichelte rote und blaue Linien stellen Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Kräfte zwischen NRI und Enhancern dar. h Mutierte Enhancer-Sequenzen des glnAp2-Promotors. Enhancer, die perfekte (P), nahezu perfekte (N) und unvollständige (I) Palindromsequenzen enthielten, wurden verwendet, um die ursprünglichen Enhance 1 und 2 zu ersetzen und neun mutierte glnAp2-Promotoren zu erzeugen. i Dynamikbereich von AcP-aktivierten Schaltkreisen mit mutierten Enhancer-Sequenzen im glnAp2-Promotor (n = 3 biologisch unabhängige Proben). „Orig“ steht für die ursprüngliche Enhancer-Sequenz, während sich der Rest auf verschiedene Kombinationen von P-, N- und I-Sequenzen an den Enhancer-Stellen 1 und 2 bezieht. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um diesen Promotor AcP-induzierbar zu machen, wurde das glnL-Gen gelöscht, was offensichtlich keinen Einfluss auf das Wachstum von E. coli hatte (ergänzende Abbildung 11). Im E. coli-Chromosom befindet sich das glnLG-Operon direkt stromabwärts des glnA-Gens, und der glnA-Terminator (TglnA) ist nicht wirksam genug, um die Transkription vollständig zu stoppen34, was zu einer selbstaktivierenden Feedforward-Schleife von NRI führt, was von uns bestätigt wird Ergebnisse, die von einem Stamm erhalten wurden, der blau und rot fluoreszierende Proteingene trägt, die TglnA flankieren (Abb. 4b). Um zu verhindern, dass der NRI-Spiegel mit der Zeit zunimmt, wurde vor dem nativen TglnA ein starker Terminator rrnB T1 eingeführt, der die Expression des rot fluoreszierenden Proteins unterbrach und den Durchlesekoeffizienten von 0,76 auf 0,06 senkte (Abb. 4b und ergänzende Abb . 12), was darauf hindeutet, dass die Rückkopplungsschleife beseitigt wurde. Diese stellten uns einen Plattformstamm zur Verfügung, um den NRI-abhängigen, auf AcP reagierenden genetischen Schaltkreis zu konstruieren.

Anschließend wurde die auf dem UND-Gatter basierende Schaltkreis-AI unter Verwendung von AcP und NRI als dualen Eingängen und grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Reporter konstruiert (Abb. 4c) und die Dosis-Wirkungs-Beziehung von AcP bestimmt. Die Fluoreszenzintensität neigte dazu, zuzunehmen und dann abzunehmen, wenn die AcP-Konzentration erhöht war (Abb. 4d). Es wurde spekuliert, dass dieses nichtmonotone Phänomen durch die Governor-Sequenz verursacht wurde, die die obere Expressionsgrenze vom glnAp2-Promotor festlegt. Daher wurde der Regler mutiert, um den Schaltkreis AII zu erzeugen, der eine monoton ansteigende Reaktionskurve aufwies (Abb. 4d). Um die Transkriptionsstärke des glnAp2-Promotors zu erhöhen, wurde das glnG-Gen von einem Plasmid unter der Kontrolle des Pj23118-Promotors anstelle des genomischen Locus überexprimiert, was zu einer maximalen GFP-Fluoreszenz führte, die 3,82-mal höher war als die des genetischen Schaltkreises AII und einen dynamischen Bereich von 10,4 -falten (Abb. 4d, e).

Um den Dynamikbereich weiter zu verbessern und eine reichhaltigere Reaktionscharakteristik auf AcP zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von NRI und Enhancer umfassend untersucht und die Enhancer-Sequenz entsprechend mutiert. Basierend auf den folgenden Fakten wurde identifiziert, dass eine Helix-Turn-Helix-Domäne (HTH) in der C-terminalen Region von E. coli-NRI Funktionen zur Enhancer-Erkennung und DNA-Bindung hat: Diese Domäne ist in NRIs verschiedener Arten konserviert (ergänzende Abb 13a) enthält es drei konservierte Reste (Arg456, Asn457 und Arg461), die eine wesentliche Rolle bei der Affinität zur DNA in Salmonella Typhimurium NRI35 spielen, und E. coli NRI mit einer mutierten HTH-Domäne reagierte nicht mehr auf die AcP-Ebene (ergänzende Abbildung 13b). ). Anschließend wurde die komplexe Struktur der DNA und der NRI-HTH-Domäne von E. coli unter Verwendung der binären Struktur der NtrC4-HTH-Domäne von Aquifex aeolicus und doppelsträngiger DNA (PDB: 4FTH) als Vorlage simuliert (Abb. 4f). Das Ergebnis legte nahe, dass a Die DNA-Sequenz GGTGCA bildete mit diesen drei konservierten Aminosäureresten durch Wasserstoffbrückenbindung und elektrostatische Kraft den stabilsten Komplex (Abb. 4g). Basierend auf dieser Struktur wurden drei Enhancer-Sequenzen mit unterschiedlicher Affinität für NRI entworfen, um die nativen Enhancer-Stellen 1 und 2 des glnAp2-Promotors im genetischen Schaltkreis AIII zu ersetzen (Abb. 4g, h), was zu einer kleinen Bibliothek mit neun mutierten glnAp2-Promotoren führte. Alle diese Biosensoren zeigten immer noch eine Reaktion auf die AcP-Konzentration, und es schien, dass die Affinität des Verstärkers für NRI positiv mit der Stärke des glnAp2-Promotors, d. h. der Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten AcP-Konzentration, korrelierte, jedoch negativ mit dem dynamischen Bereich der entsprechenden Biosensoren korrelierte ( Abb. 4i). Insgesamt wurde der Schaltkreis AIIIf mit dem höchsten Dynamikbereich von 30,3-fach, geringer basaler Leakage-Expression und akzeptabler Expressionsstärke bei hohem AcP-Spiegel ausgewählt (Abb. 4d).

Als nächstes wurde der Ausdruck von NRI angepasst. Wenn das glnG-Gen unter der Kontrolle eines schwächeren Promotors Pj23116 überexprimiert wurde, erhöhte sich der dynamische Bereich auf das 57,1-fache, das maximale Ausgangssignal war jedoch niedriger als das des Schaltkreises AIIIf (Abb. 4d, e). Für den Fall, dass das glnG-Gen von seinem ursprünglichen genomischen Locus aus exprimiert wurde, sank das maximale Ausgangssignal weiter und der Dynamikbereich betrug das 27,9-fache (Abb. 4d, e). Insgesamt wurde eine Reihe von AcP-aktivierten genetischen Schaltkreisen mit unterschiedlichen Schaltzeiten, Regulierungsintensitäten und Dynamikbereichen durch Anpassen der cis-wirkenden Sequenzen (Enhancer und Gouverneure) und der trans-wirkenden Element-NRI-Expression des Promotors glnAp2 erhalten.

Der genetische Schaltkreis für die negative Reaktion von AcP wurde auf der Grundlage der folgenden Idee konstruiert, d aus dem Protomer PphlF (Abb. 5a). In dem Stamm, der ein anfängliches Konstrukt RI trug, wurde das PhlF-Protein spezifisch als Reaktion auf die Zugabe von AcP exprimiert (Abb. 5b). Darüber hinaus wurde eine AcP-abhängige Unterdrückung der GFP-Fluoreszenz beobachtet, und diese Unterdrückung wurde durch die Zugabe von 2,4-Deacetylphloroglucinol (DAPG) untergraben, das an das PhlF-Protein binden und es vom PphlF-Promotor freisetzen kann (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass die Unterdrückung erfolgte wird durch den PhlF-Repressor vermittelt, ist aber keine direkte Wirkung von AcP. Dieser Stamm zeigte jedoch eine hohe Reaktionsschwelle für AcP und eine quantitative Leaky-Expression bei hoher AcP-Konzentration.

a Design des AcP-Negativ-Antwort-Schaltkreises. Das Pseudomonas fluorescens-Repressorgen phlF wurde durch den glnAp2-Promotor kontrolliert, und das PhlF-Protein hemmt die Expression des Promotors PhlF. Die mutmaßliche PhlF-Bindungssequenz wurde gezeigt. 2,4-Deacetylphlorogluicnol (DAPG) kann PhlF vom PphlF-Promotor freisetzen. b Expression des PhlF-Proteins bei verschiedenen AcP-Konzentrationen. Die unter verschiedenen AcP-Konzentrationen gezüchteten Zelllysate des Stamms Q4562, der den AcP-inhibierten Schaltkreis RI trägt, wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassie-Blau-Färbung und Anti-His6-Immunoblot sichtbar gemacht. Ähnliche Ergebnisse wurden aus zwei biologisch unabhängigen Proben erhalten und ein repräsentatives Ergebnis angezeigt. c Validierung des PhlF-abhängigen AcP-inhibierten Schaltkreises (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die Unterdrückung wurde durch die Mutation der phlO-Sequenz und die Zugabe von DAPG untergraben. d Wirkung zusätzlicher phlO-Operatoren stromabwärts des PphlF-Promotors auf den AcP-inhibierten Schaltkreis. Es wurden GFP-Fluoreszenz (n = 3 biologisch unabhängige Proben) und mRNA-Spiegel (n = 3 biologisch unabhängige Proben mit zwei technischen Wiederholungen) ohne PhlF-Protein gezeigt. e Wirkung des zusätzlichen vorgeschalteten phlO-Operators und der PhlF-Oligomerisierung auf AcP-inhibierte Kreisläufe (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Ein phlO-Operator wurde stromaufwärts des PphlF-Promotors mit einem Abstand der Zentren zweier phlO-Sequenzen von 63 bp eingefügt. Die C-terminale Domäne des λ-Phagenrepressors cI und verschiedene Linkerpeptide wurden mit PhlF fusioniert, um dessen Oligomerisierung zu vermitteln. f Auswirkung des Abstands zwischen zwei Bedienern auf AcP-inhibierte Kreisläufe (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Es wurde das Protein PhlF-(PT)4P-cI verwendet. Die gepunktete Linie stellte die Fluoreszenzintensität ohne vorgeschalteten Operator dar. g Weitere Verfeinerung des Einflusses des Abstands zwischen zwei Bedienern (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Genetische Schaltkreise mit einem Abstand von 48–80 bp wurden konstruiert und bei einer AcP-Konzentration von 2,14 mM/OD getestet. h Eigenschaften von AcP-inhibierten Kreisläufen mit manipuliertem PhlF und Operatoren (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Fehlerbalken, Mittelwert ± SD. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um diese Repressionskonfiguration zu verbessern, wurde eine zusätzliche Kopie der PhlF-Bindungsstelle phlO in den PhlF-Promotor eingefügt, um die Affinität des PhlF-Repressors für diesen Promotor zu stärken. Zwischen den Regionen –35 und –10 des PphlF-Promotors wurde eine 24-bp-Sequenz mit invertierten Wiederholungen als mutmaßlicher phlO-Operator angesehen, und ihre Mutation hob die PhlF-vermittelte Repression auf dem PphlF-Promotor vollständig auf (Abb. 5c). Anschließend wurden eine bzw. zwei Kopien des phlO-Operators stromabwärts der Transkriptionsstartstelle eingefügt, wie in Abb. 5d gezeigt. Überraschenderweise wurde nach der Insertion von phlOs auch in Abwesenheit des PhlF-Proteins eine schrittweise Abnahme der Fluoreszenz beobachtet, der gfp-mRNA-Spiegel änderte sich jedoch nicht signifikant (Abb. 5d). Es wurde angenommen, dass dieses Phänomen durch die Sekundärstruktur der 5'-untranslatierten Region verursacht wurde, die durch zusätzliche phlO-Sequenz stabilisiert wurde (ergänzende Abbildung 14) und die Translationsinitiierung nachgeschalteter Gene beeinflusste. Dann wurde ein phlO-Operator stromaufwärts des PphlF-Promotors eingefügt, wobei der Abstand zwischen den Zentren zweier phlO-Sequenzen 63 bp betrug. Diese Insertion veränderte jedoch weder das Expressionsmuster von GFP in Gegenwart noch in Abwesenheit von PhlF-Protein (RIII in Abb. 5e und ergänzende Abb. 15).

Damit diese Operatoren synergetisch wirken, besteht eine Methode in der Erzeugung einer DNA-Schleife durch ein Protein oder einen Proteinkomplex, der gleichzeitig an zwei getrennte Stellen auf einem DNA-Molekül bindet37. Da das PhlF-Protein normalerweise ein Dimer bildet, das an zwei invertierte Wiederholungen in einem phlO-Operator bindet, und keinen Komplex höherer Ordnung bilden kann36, wurde es mit der C-terminalen Domäne des λ-Repressors cI38 fusioniert, was eine intermolekulare Wechselwirkung vermittelt, die zur kooperativen Bindung zweier PhlF führt Dimere zu benachbarten phlO-Operatoren (Abb. 5e). Wie wir erwartet hatten, reduzierte die Einführung der Oligomerisierungsdomäne die Reaktionsschwelle von AcP und der Leaky-Expression effektiv. Anschließend wurden mehrere Peptidlinker zwischen PhlF und der cI-Domäne eingefügt, um die räumliche Trennung zu erhöhen und die gegenseitige Beeinflussung zwischen den Domänen zu vermeiden. Unter ihnen zeigte der Linker (PT)4 P die höchste Unterdrückungsleistung (Abb. 5e).

Als nächstes wurde der Abstand zwischen zwei phlO-Operatoren angepasst, um seine Auswirkung auf die DNA-Schleife zu untersuchen. Wie in Abb. 5f gezeigt, nahm die Fluoreszenzausbeute zu, als phlOup allmählich entfernt wurde, und die DNA-Looping-abhängige Unterdrückung funktionierte hauptsächlich im Abstandsbereich von 47–297 bp. Darüber hinaus wurde der Spacer weiter auf 48, 50, 52…78, 80 bp verfeinert, und das Ausgangssignal zeigte eine abstandsabhängige periodische Fluktuation mit einer Periode von 11 bp, was genau der Anzahl der Basenpaare pro Helixwindung entspricht doppelsträngige DNA (Abb. 5g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Bildung von DNA-Schleifen durch die relative Richtung zweier Operatoren auf dem DNA-Molekül beeinflusst wird. Insbesondere wenn die beiden Operatoren in ihrer Position abgelenkt sind oder sich auf gegenüberliegenden Seiten befinden, wird die DNA-Schleife aufgrund der starren Wirkung der DNA-Helix strukturell instabil, was zu einer Verringerung ihrer Unterdrückungsleistung führt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die zwischen phlOup und PphlF-Promotor gebildete Raumpackung vernachlässigbar war und die Transkription vom PphlF-Promotor nicht beeinflusste, solange ihr Abstand mehr als 7 bp betrug (ergänzende Abbildung 16). Darüber hinaus wurden die AcP-Reaktionseigenschaften von drei genetischen Schaltkreisen mit manipuliertem PhlF-Repressor und einem unterschiedlichen Abstand von zwei phlO-Operatoren von 60, 63 bzw. 66 bp bestätigt (Abb. 5h). Die Ergebnisse zeigten, dass alle drei genetischen Schaltkreise ein deutlich verbessertes Repressionsprofil als das ursprüngliche Konstrukt aufwiesen und derjenige mit 66-bp-Spacer zwischen phlO-Operatoren eine schnellere Signalantwort, eine bessere Kooperationsfähigkeit und eine geringere Leakage-Expression als die anderen aufwies.

Schließlich wurde die Portabilität der dynamischen AcP-aktivierten und -inhibierten genetischen Schaltkreise durch Ersetzen des Reporter-GFP durch β-Galactosidase (β-Gal) verifiziert und ein geeignetes Expressionsprofil von β-Gal unter Bedingungen mit verschiedenen intrazellulären AcP-Konzentrationen erhalten ( Ergänzende Abbildung 17). Zusammenfassend wurde eine Reihe von auf AcP reagierenden genetischen Schaltkreisen mit unterschiedlichen Eigenschaften konstruiert, die zur Steuerung der Expression von Stoffwechselenzymen verwendet werden können.

Da die dynamische Expression metabolischer Gene die Kompromisse zwischen Wachstum und Produktion besser bewältigen und die Ausbeute und den Titer der Zielprodukte steigern kann24, werden die auf AcP reagierenden Schaltkreise zur Steuerung der Transkription von Genen eingesetzt, die mit der Produktion und dem Verbrauch von AcP zusammenhängen Routen. Insbesondere werden die AcP-aktivierten Schaltkreise zur Steuerung des AcP-Verbrauchswegs verwendet, d SCTPK. Infolgedessen wird das bakterielle Schicksal in zwei Modi des gegenseitigen Kreislaufs unterteilt (Abb. 6a). Die Manifestation und der Wechsel dieser beiden Schicksale werden nur durch die intrazelluläre Konzentration von AcP bestimmt.

a Die alternierenden zellulären Zustände, die von AcP-Antwortoszillatoren dargestellt werden. Dieser Metabolator besteht aus einem Netzwerk mit Pools von zwei Metaboliten, AcP und Acetyl-CoA, die von den Enzymen Xfspk und Pta produziert werden, deren Expression durch AcP negativ bzw. positiv reguliert wird. In Zustand A, in dem AcP niedrig ist, wird Xfspk zusammen mit GFP exprimiert. Die Akkumulation von AcP unterdrückt Xfspk und reguliert Pta und mCherry hoch, wodurch Acetyl-CoA aus AcP entsteht. Mit der Abnahme des AcP-Spiegels und dem Anstieg des Acetyl-CoA-Spiegels wird Xfspk erneut exprimiert und Pta deaktiviert und kehrt in den Zustand A zurück. b–f Quantifizierung der relativen Fluoreszenz über die Zeit von E. coli-Stämmen, die jeweils Oszillatoren IV tragen (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Detaillierte Strukturen dieser Oszillatoren sind in der ergänzenden Abbildung 18 dargestellt. g Die intrazelluläre AcP-Konzentration des E. coli-Stammes Q4602, der SCTPK und Oszillator III trägt (n = 3 biologisch unabhängige Proben). h Anti-Acetyllysin-Immunblot-Analysen von Ganzzellproteinen von E. coli BW25113, Q4531, die die SCTPK tragen, und Q4602. Die Ganzzelllysate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassie-Blau-Färbung und Anti-Acetyllysin-(Anti-AcK)-Immunoblot sichtbar gemacht. Ähnliche Ergebnisse wurden aus zwei biologisch unabhängigen Proben erhalten und ein repräsentatives Ergebnis angezeigt. i Relativer mRNA-Spiegel von xfspk und pta im Stamm Q4602, bestimmt durch qRT-PCR (n = 3 biologisch unabhängige Proben mit zwei technischen Wiederholungen). j Räumliches Muster, gebildet durch Stamm Q4602. Die Zellen wurden homogen auf einer Agarplatte ausgebreitet und eine mit 15 μl 1 M AcP getränkte Papierscheibe in die Mitte gelegt, um einen radialen AcP-Gradienten zu erzeugen. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit konstitutiv exprimiertem GFP und mCherry (oberer Abschnitt) verwendet. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um dieses Schema umzusetzen, wurde der konstruierte Aktivierungsschaltkreis AI zur Steuerung der Transkription der Gene pta und mcherry sowie der Schaltkreis RI zur Steuerung der Expression von xfspk und gfp verwendet, um ein Prototypgerät I zu erzeugen (ergänzende Abbildung 18). Wie erwartet deuteten die Fluoreszenzexpressionskurven darauf hin, dass GFP und mCherry eine oszillierende Expression in entgegengesetzten Phasen zeigten. Es wurde jedoch eine höhere GFP-Amplitude als bei mCherry beobachtet und der oszillierende Ausdruck wurde nach zwei Zyklen allmählich unscharf (Abb. 6b). In Oszillator II wurde der glnAp2-Promotor durch sein Derivat mit optimierter Enhancer-Sequenz ersetzt, was zu einem verringerten Expressionsverlust von mCherry führte, das Oszillationsverhalten war jedoch immer noch nicht nachhaltig (Abb. 6c).

Als nächstes wurde in Oszillator III der Aktivator-NRI von einem Plasmid unter der Kontrolle des Pj23116-Promotors anstelle seines genomischen Locus exprimiert, um den NRI-Spiegel zu erhöhen, und der abschreckende Treiber des Repressionszweigs wurde auf gentechnisch verändertes PhlF-(PT)4P-cI umgestellt und PphlF-Promotor mit doppelten phlO-Operatoren zur Verbesserung der Repressionseffizienz. Infolgedessen wurde ein anhaltender Oszillationszustand mit einem Zyklus von etwa 12 Stunden beobachtet, und zwei Module hatten ähnliche Amplituden und entgegengesetzte Phasen, was zeigt, dass dieses Gerät eine bessere Synchronisationsabstimmbarkeit, höhere Robustheit und eine stärkere Widerstandsfähigkeit gegen Rauschen aufwies (Abb. 6d). ). Eine weitere Erhöhung des NRI-Spiegels durch Verwendung eines stärkeren Promotors Pj23118 im Oszillator IV beschleunigte den Oszillationsrhythmus, was alle 9 Stunden zum Wechsel zweier Modi führte (Abb. 6e). Allerdings kam es im Aktivierungsmodul zu einem gewissen Grad an Leakage-Expression des mCherry-Gens, und auch die Amplitude von mCherry war höher als die von GFP. Um die Hintergrundexpression von mCherry zu senken, wurde das lacI-Gen stromabwärts des PphlF-Promotors im Repressionsmodul platziert, um den Repressor LacI zu produzieren, der negativ mit dem intrazellulären AcP-Spiegel korreliert und den glnAp2-Promotor im Aktivierungsmodul blockiert. Interessanterweise reduzierte dies nicht nur den mCherry-Ausdruck und verlängerte die Umschaltzeit im Vergleich zu Oszillator IV, sondern führte auch zu einem allmählichen Abfall der Amplitude von mCherry und GFP, um eine gedämpfte Schwingung zu erzeugen (Abb. 6f). Darüber hinaus wurden in E. coli-Zellen, die die synthetischen Schwingungsnetzwerke tragen, Farbprofile mit mehreren visuellen Gradienten beobachtet (ergänzende Abbildung 19), was auf die Wirksamkeit und die vielfältigen Reaktionsmerkmale dieser Schwingkreise hinweist.

Um die Wirkung des Oszillationssystems direkt zu bewerten, wurden die intrazelluläre AcP-Konzentration und das Transkriptionsniveau der pta- und xfspk-Gene im Stamm Q4602 bestimmt, der SCTPK und Oscillator III trägt. Wie in Abb. 6g gezeigt, schwankte der AcP-Spiegel um 2 mM/OD, was viel niedriger war als der im Stamm Q4531, der nur SCTPK trug. Darüber hinaus brachte die Verringerung der AcP-Konzentration auch die Proteinacetylierung wieder auf ein ähnliches Niveau wie beim Wildtyp-Stamm (Abb. 6h), wodurch mögliche ungünstige regulatorische Auswirkungen durch die AcP-Akkumulation vermieden wurden. Darüber hinaus wurden die Gene pta und xfspk in entgegengesetzten Phasen oszillierend transkribiert, und der mRNA-Spiegel von pta änderte sich synchron mit der intrazellulären AcP-Konzentration (Abb. 6i).

Neben der periodischen Schwingung über die Zeit könnte unser Oszillator auch eine räumliche Musterung ermöglichen. Wie in Abb. 6j gezeigt, wurde der Stamm Q4602, der SCTPK und Oszillator III trägt, homogen auf einer Agarplatte verteilt und eine zentrale AcP-Quelle hinzugefügt, um einen radialen Gradienten zu bilden. Durch die Expression unterschiedlicher Fluoreszenzproteine ​​interpretierte die isogene Bakterienpopulation den AcP-Gradienten in zwei diskrete Farbzonen: Rot und Grün, genau wie die Flagge von Bangladesch. Im Gegensatz dazu zeigte eine Bakterienpopulation, die unregulierte gfp- und mCherry-Gene trug, trotz des AcP-Gradienten nur ein einheitliches Gelb.

Insgesamt wurden durch die Integration von Transkriptionsregulation und technischem Stoffwechsel fünf oszillierende Geräte konstruiert, die in drei Kategorien eingeteilt werden konnten: nicht anhaltende, anhaltende und gedämpfte Oszillation. Das aufgebaute Oszillationsnetzwerk ist in der Lage, die Expression von Stoffwechselgenen präzise, ​​spontan und in Echtzeit zu regulieren, um die Homöostase von AcP in E. coli-Zellen aufrechtzuerhalten.

Das ultimative Ziel des Aufbaus eines künstlichen Netzwerks einschließlich SCTPK und Oszillatoren besteht darin, die Kohlenstoffatomökonomie während der Biosynthese von Chemikalien und Materialien zu verbessern. In diesem Netzwerk ist die SCTPK der Teil „AcP-Erzeugung“, der mehr Kohlenstoffatome zum zentralen Stoffwechselzwischenprodukt AcP leitet und die theoretische Obergrenze der Atomumwandlung erhöht. Biosyntheseweg-Gene bilden zusammen mit PTA den nachgeschalteten Abschnitt „Bioproduktion“ und den Oszillator reguliert die Transkription verwandter Gene als Reaktion auf den intrazellulären AcP-Spiegel (Abb. 7a). Hier wurden drei Produkte, 3HP, PHB und MVA, als Proxy für den Machbarkeitsnachweis angepasst (Abb. 7b). Um zu testen, ob mikrobielle Zellfabriken, die mit diesem Oszillatorsystem ausgestattet sind, eine bessere Leistung aufweisen, wurden auch zwei Arten von Stämmen konstruiert, bei denen die Biosynthesegene mit einem statischen Kontrollmodell und einem dynamischen Schalter reguliert werden (ergänzende Abbildung 20).

ein Schema des künstlichen Netzwerks, aufgeteilt in zwei Modelle zur Biosynthese von Chemikalien und Materialien. b Biosynthesewege von 3HP, MVA und PHB unter Verwendung von AcP als Vorläufer. Gene wurden nach drei verschiedenen Strategien reguliert, einschließlich statischer Kontrolle, dynamischem Schalter und oszillatorischer Regulierung, wie in den ergänzenden Abbildungen gezeigt. 21, 23–24. pta, Phosphatacetyltransferase; mvaE, Acetyl-CoA-Acetyltransferase/HMG-CoA-Reduktase; mvaS, Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase; phaA, Acetyl-CoA-Acetyltransferase; phaB, 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase; phaC, 3-Hydroxybutyrat-Polymerase; accADBC, Acetyl-CoA-Carboxylase-Komplex; mcr, Malonyl-CoA-Reduktase. c Wachstumskurve von Stämmen für die 3HP-Produktion während der Kultivierung im Schüttelkolben unter Verwendung von Glucose als einziger Kohlenstoffquelle (n = 3 biologisch unabhängige Proben). d Der 3HP-Titer und die Ausbeute von Stämmen mit verschiedenen Regulierungsstrategien (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die gestrichelte Linie stellt die native theoretische Ausbeute von 3HP aus Glucose dar. e Anreicherung von Acetat und Laktat der Stämme Q4607 und Q4617 bei der 3HP-Produktion (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Das Laktat wurde in der Q4617-Kultur nicht nachgewiesen. Zellwachstum und 3HP-Produktion (f), intrazelluläre AcP-Konzentration (g) und relativer mRNA-Spiegel von xfspk und pta (h) des Stammes Q4617 während einer aeroben Fed-Batch-Fermentation in einem 5-L-Bioreaktor. Ähnliche Ergebnisse wurden aus zwei biologisch unabhängigen Proben erhalten und ein repräsentatives Ergebnis angezeigt. Produktion von MVA (i) und PHB (j) unter Verwendung von Stämmen mit verschiedenen Regulierungsstrategien bei der Kultivierung in Schüttelkolben (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die gestrichelte Linie stellt die native theoretische Ausbeute dar. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-t-Tests durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

3HP gehörte zu den 12 wertvollsten Chemikalien aus Biomasse39 und wird aus Acetyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase ACC und die Malonyl-CoA-Reduktase MCR40 hergestellt. MCR katalysiert die zweistufige Reduktion von Malonyl-CoA zu 3HP, und seine N- und C-terminalen Fragmente sind funktionell unterschiedlich und zeigen Alkoholdehydrogenase- bzw. Aldehyddehydrogenase-Aktivität. Darüber hinaus führte die segmentale Expression von MCR zu einer höheren Gesamtenzymaktivität und einer verbesserten 3HP-Produktion7,41. Daher wurden hier die sezierten Gene mcr-n und mcr-c verwendet. Unter dem statischen Kontrollmodell wurden die Gene xfspk, pta, accABCD, mcr-n und mcr-c bei Bedarf in Wildtyp-E. coli BW25113, Q3952 und Q4531 konstitutiv exprimiert. Die Stämme mit dynamischem Schaltermodell exprimierten das xfspk-Gen konstitutiv und die Transkription anderer Gene wurde durch die AcP-Sensoren AI und AV aktiviert. Im Gegensatz dazu wurden diese Gene in anderen Stämmen einer automatischen dynamischen Aktivierung oder Repression unter Verwendung der Oszillatoren I–IV unterzogen (ergänzende Abbildung 21). Bei der Kultivierung im Schüttelkolben verlangsamte die Integration von SCTPK und Oszillatoren das Wachstum leicht und verringerte die endgültige Zelldichte (Abb. 7c), während die 3HP-Produktion und -Ausbeute deutlich gesteigert wurde (Abb. 7d). Der Stamm Q4607 (BW25113 trägt den 3HP-Weg) akkumulierte nach 72-stündiger Kultivierung 0,93 g/L 3HP mit einer Ausbeute von 0,09 g/g Glucose, während die Deletion von Genen im Stamm Q4634 (Q3952 mit dem 3HP-Weg) die 3HP-Produktion leicht steigerte Die Integration von SCTPK erhöhte den 3HP-Titer und die Ausbeute auf 1,75 g/L bzw. 0,23 g/g Glucose. Anschließend verbesserten der AcP-abhängige dynamische Schalter und die Oszillatoren die Bioproduktion von 3HP weiter. Schließlich wies der Stamm Q4617, der SCTPK und Oszillator IV beherbergte, den höchsten 3HP-Titer von 7,60 g/L und eine Ausbeute von 0,71 g/g Glucose auf, die beide mehr als achtmal höher waren als die des ursprünglichen Stamms Q4607 (Abb. 7d). Unterdessen akkumulierte der Stamm Q4607 eine beträchtliche Menge an Acetat und Laktat, 4,67 g/l bzw. 3,07 g/l, und in der Kultur des Stamms Q4617 wurden nur 0,33 g/l Acetat nachgewiesen (Abb. 7e), wahrscheinlich aufgrund der verminderten intrazellulären Konzentration Pyruvatspiegel. Dieses Ergebnis legt nahe, dass SCTPK und Oszillator die Kohlenstoffatomökonomie während der 3HP-Fermentation auf zwei Arten verbesserten: Steigerung der Acetyl-CoA-Ausbeute aus Glucose und Hemmung der Nebenproduktsynthese.

Darüber hinaus wurde eine Fed-Batch-Fermentation in einem 5-L-Bioreaktor mit dem Stamm Q4617 durchgeführt. Während der Fermentation schwankte die Transkription von pta und xfspk periodisch als Reaktion auf die intrazelluläre AcP-Konzentration (Abb. 7g, h), was darauf hindeutet, dass unser Oszillatorsystem auch bei einer Kultivierung in größerem Maßstab eine hohe Robustheit aufweist und in der Lage ist, AcP zu erfassen und die Expression von Stoffwechselvorgängen zu regulieren Gene präzise und anhaltend. Es wurde auch festgestellt, dass das Belüftungsverhältnis eine wichtige Rolle bei der 3HP-Produktion spielt (ergänzende Abbildung 22). Unter optimierten Bedingungen produzierte unser rekombinanter Stamm Q4617 nach 108-stündiger Fermentation 73,42 g/L 3HP mit einer Ausbeute von 0,51 g/g Glucose (Abb. 7f). Nach unserem besten Wissen ist dies die höchste 3HP-Produktion, die über den Malonyl-CoA-Weg in manipulierten Mikroben gemeldet wurde.

MVA ist ein wertvoller Vorläufer für die Terpenoid-Biosynthese und PHB ist ein biologisch abbaubarer und biokompatibler Thermoplast. Anschließend wurden die synthetischen Gene von MVA und PHB mit drei verschiedenen Regulationsmodellen zu rekombinanten E. coli-Stämmen zusammengesetzt (ergänzende Abbildungen 23 und 24) und die Fermentation im Schüttelkolben und im 5-l-Bioreaktor durchgeführt (Abb. 7i, j und ergänzende Abbildungen 25 und 26). Ähnlich wie bei 3HP erhöhte die Neukonfiguration des zentralen Stoffwechsels auf SCTPK die MVA-Produktion von 0,78 g/L auf 1,25 g/L und die PHB-Produktion von 0,42 g/L auf 1,00 g/L, und die Ausbeuten an MVA und PHB aus Glucose wurden um erhöht 1,29- bzw. 1,06-fach. Durch den Zusammenbau des AcP-abhängigen dynamischen Schalters und der Oszillatoren wurde die Bioproduktion von MVA und PHB weiter verbessert. Der Stamm Q4624 wies mit 4,67 g/L den höchsten MVA-Titer auf, was 5,99-mal höher war als der des ursprünglichen Stamms Q4618, und die MVA-Ausbeute betrug 0,61 g/g Glucose, was 95 % der theoretischen MVA-Ausbeute unter Verwendung von SCTPK (0,64) erreichte g/g) und übersteigt die native theoretische Ausbeute (0,54 g/g). Der beste Stamm für die PHB-Produktion war Q4632, der 3,31 g/L PHB akkumulierte, und seine Umwandlungseffizienz von Glucose in PHB erreichte 0,41 g/g, was 85 % bzw. 71 % seiner nativen theoretischen Ausbeute (0,48 g/g) und der theoretischen Ausbeute entspricht Ausbeute unter Verwendung von SCTPK (0,58 g/g). Darüber hinaus wurde die Ausscheidung der Nebenprodukte Acetat und Laktat während der Fermentation von MVA und PHB unterdrückt (ergänzende Abbildung 25c, d). Alle diese Ergebnisse zeigten, dass wir eine universelle E. coli-Plattform zur Herstellung von Acetyl-CoA-abgeleiteten Chemikalien und Materialien mit hoher Kohlenstoffatomökonomie entwickelt haben.

In dieser Studie wurde eine universelle Synthesemaschinerie mit hoher Kohlenstoffatomökonomie konstruiert. Zunächst wurde der kohlenstoffsparende Weg SCTPK etabliert, der Glucose ohne Kohlenstoffverlust in stöchiometrische Mengen AcP umwandelt, basierend auf der Einführung von trifunktioneller Phosphoketolase und SBPase (Abb. 1). Zweitens wurden Oszillationssysteme entwickelt, die genetische Schaltkreise mit verschiedenen Reaktionseigenschaften auf AcP nutzen, die die intrazelluläre AcP-Homöostase aufrechterhalten und die zellulären Ressourcen zwischen Zellwachstum und der Synthese von Zielchemikalien ausgleichen. Schließlich wurde mit dieser Synthesemaschinerie die Biosynthese mehrerer Chemikalien durchgeführt, was im Vergleich zum natürlichen Zentralstoffwechsel von E. coli oder zu Flussregulierungsmodi, einschließlich häufig verwendeter statischer Steuerung und dynamischem Schalter, eine viel höhere Produktion und Ausbeute jedes Produkts darstellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kombination aus dem Aufbau eines kohlenstoffsparenden Signalwegs und einer dynamischen Oszillationsregulation als Reaktion auf einen Schlüsselmetaboliten eine attraktive Strategie zur Verbesserung der Leistung mikrobieller Zellfabriken darstellt.

Für heterotrophe Mikroorganismen ist die Kohlenstoffausbeute einer der wichtigsten Parameter zur Bewertung ihrer industriellen Bioproduktionsleistung42. Ein typisches Bioproduktionssystem verliert während des Produktionsprozesses mehr als 30 % Kohlenstoff. Es gibt zwei Hauptansätze, um die Obergrenze des Kohlenstoffertrags anzuheben. Eine besteht darin, Carboxylierungsreaktionen zur CO2-Fixierung einzusetzen, wie der Succinat-Biosyntheseweg, bei dem Succinat mit zwei CO2-Fixierungsreaktionen aus Acetyl-CoA abgeleitet wurde43, aber das funktioniert nur mit bestimmten Stoffwechselwegen. Der andere Ansatz besteht darin, die Decarboxylierung zu vermeiden, wie es NOG tut, indem es die Pyruvat-Decarboxylierung umgeht, um schließlich Acetyl-CoA12 zu erzeugen, einen Grundstein für eine Vielzahl von Metaboliten, darunter Lipide, Alkane und Polymere.

Hier wurde gezeigt, dass ein weiterer kohlenstoffsparender Weg, SCTPK, in E. coli effizient und manipulierbar ist. Dieser trifunktionale Phosphoketolase-abhängige Zyklus wurde mithilfe der Pull-Push-Promote-Strategie ganzheitlich konstruiert und optimiert. Insbesondere liefern durch Xfspk und SBPase katalysierte irreversible Reaktionen die treibende Kraft und schieben den Kohlenstofffluss in diesen Kohlenstoffkonservierungszyklus (Abb. 2a). Zweitens wurde die Expression des Gens xfspk, das für das geschwindigkeitsbestimmende Enzym kodiert, verstärkt, indem dieses Gen auf einem Plasmid mit hoher Kopienzahl platziert wurde, um die Synthese von AcP aus S7P, F6P und X5P zu fördern. Drittens wurden Gene, die an der Produktion von Acetat, Laktat, Ethanol und Formiat beteiligt sind, ausgeschaltet, um den Kohlenstoffverlust zu verhindern und so Nebenprodukt-Kohlenstoff in den Zielweg zu ziehen. Außerdem wurde die Expression von PfkA-, GapA- und GapB-Proteinen, die die SCTPK umleiten könnten, unterdrückt hierarchisch durch kombinatorische asRNA-Arrays, um die Funktion von SCTPK weiter zu verbessern (Abb. 2a und 3a). Diese technische Strategie hat hervorragende Ergebnisse erzielt: Der resultierende Stamm Q4531 wies eine intrazelluläre AcP-Konzentration von 5,73 mM/OD auf, 2,83-mal höher als die des Wildtyp-Stamms E. coli BW25113 (Abb. 3f), und die maximale CO2-Freisetzungsrate von Der Stamm Q4531 machte nur weniger als ein Drittel des Stamms BW25113 aus (Abb. 3h). In Verbindung mit dem MVA-Biosyntheseweg und dem auf AcP reagierenden Oszillator erreichte die MVA-Ausbeute aus Glucose 0,61 g/g und übertraf damit die native MVA-theoretische Ausbeute von 0,54 g/g (Abb. 7i). Alle diese Ergebnisse zeigten, dass SCTPK die Kohlenstoffatomökonomie während des Biokonvertierungsprozesses verbesserte und als neue Kohlenstoffsequestrierungsplattform zur Herstellung kritischerer oder hochwertigerer Chemikalien eingesetzt werden könnte.

Es gibt jedoch immer noch ein Problem: SCTPK allein erzeugt kein ATP und keine reduzierende Energie (Abb. 2a), die für das Zellwachstum und die Produktion von Chemikalien wie 3HP, MVA und PHB erforderlich sind. In unseren Stämmen sind die nativen Wege von E. coli für den Glukosekatabolismus, einschließlich Glykolyse, Entner-Doudoroff-Weg und der verbleibende obere Abschnitt des Phosphatpentosewegs, immer noch funktionsfähig und können Energie und Reduktionsäquivalente produzieren. Darüber hinaus können Zellen über den TCA-Zyklus und die Atmung ATP und NAD(P)H erzeugen. Daher glauben wir, dass ATP und die für das Zellwachstum und die Biosynthese erforderliche Reduktionskraft über die nativen Wege von E. coli bereitgestellt werden und die Hauptaufgabe von SCTPK darin besteht, AcP aus Glucose ohne CO2-Freisetzung zu produzieren, um die Produktion und Ausbeute von Acetyl-CoA zu verbessern Chemikalien. Diese Situation ähnelt dem zuvor berichteten rekombinanten Stamm, der NOG trägt44. Derzeit werden mehrere Hybridrouten durch gleichzeitige Überexpression von NOG und basalem Zentralstoffwechsel etabliert45,46,47. Bei diesen Strategien wird die Energie im Wesentlichen durch Kohlenstoffatome ergänzt, und diese Stitching-Praxis führt zu einer theoretischen Kohlenstoffausbeute von 61,1–83,3 %48. Jetzt kann elektrischer Strom auf nachhaltige Weise erzeugt und zur Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten und Energie im mikrobiellen Elektrosynthesesystem verwendet werden49. Es wird davon ausgegangen, dass die Anwendung der elektrisch angetriebenen Erzeugung von ATP und des Reduktionsäquivalents in kohlenstoffsparenden Plattformstämmen eine wirksame Lösung darstellt.

In dieser Studie haben wir mehrere Oszillatorsysteme entworfen und konstruiert, die spontan auf AcP reagieren. Sie spüren das Gleichgewicht zwischen zwei sich gegenseitig umwandelnden Metabolitenpools (AcP und Acetyl-CoA), die von zwei Enzymen Xfspk und Pta produziert werden, deren Expression durch AcP negativ bzw. positiv reguliert wird (Abb. 5). Im Vergleich zu den zuvor konstruierten NRI-abhängigen AcP-Sensoren 22, 23 wurden unsere genetischen Schaltkreise optimiert, indem die Affinität des Aktivator-NRI oder des Repressor-PhlF zu entsprechenden Promotoren angepasst wurde, was zu vielfältigeren Oszillatorsystemen mit längerer Dauer führte, die ein breites Anwendungsspektrum in der Biosynthese haben verschiedener Chemikalien und Materialien. Beispielsweise wurden die höchsten Produktionen von MVA und PHB mit Oszillator III und 3 PS mit Oszillator IV erzielt (Abb. 7d, i, j). Bei Stämmen, die die Daueroszillatoren tragen, wurden sowohl bei der Kultivierung im Schüttelkolben als auch bei der Fed-Batch-Fermentation periodische Schwankungen der intrazellulären AcP-Konzentration und des Genexpressionsniveaus beobachtet (Abb. 6g, i und 7g, h), was auf eine hohe Prozessrobustheit und Skalierbarkeit dieser Oszillationen schließen lässt Systeme. Die Stoffwechselnetzwerke von Mikroben sind stark reguliert und reagieren auf Umweltbedingungen. Diese Anpassungsfähigkeit kann sich positiv auf das Überleben und Wachstum der Zellen auswirken, führt jedoch häufig zu einer inkonsistenten Fermentationsleistung und beeinträchtigt die Produktsynthese in einem industriellen Prozess, was zu Schwierigkeiten bei der Prozessentwicklung und -skalierung führt50. Es wird angenommen, dass diese Oszillationssysteme, die biologische Prozesse vorhersehbarer und wiederholbarer machen, das Potenzial haben, die Optimierung und Ausweitung der Bioproduktion anderer wertvoller Chemikalien zu vereinfachen.

Die oszillierende Regulierung des Kohlenstoffflusses verbesserte in unserer Studie die Produktion und Ausbeute der Zielchemikalien und -materialien erheblich. Beim Metabolic Engineering gibt es mehrere Strategien zur Modulation des Stoffwechselflusses. Statische Regulierungsmittel sind beispielsweise einfach zu bedienen und haben kurze Zykluszeiten, wie z. B. Überexpression und Knockout von Genen, Modifikationen von RBS-Stellen, Optimierung der Plasmidkopienzahl. Dennoch bringen diese Ansätze in der Regel Probleme wie die Ansammlung von Zwischenmetaboliten und die Verschwendung von Kohlenstoffquellen mit sich9,51. Der dynamische Schalter mildert die Auswirkung der Einführung exogener Signalwege auf die ungleichmäßige Verteilung von Ressourcen innerhalb der Zelle. Wenn es jedoch zu einer übermäßigen Anreicherung oder einem übermäßigen Verbrauch einer wichtigen intrazellulären Komponente oder Verbindung kommt, würde dies den globalen Stoffwechsel der Zelle beeinträchtigen9,51,52. Hier bietet ein Oszillationsmodell, das auf einer ausgeklügelten Erfassung des Schlüsselmetaboliten AcP, dem unmittelbaren Produkt der SCTPK und Vorstufe von Acetyl-CoA und der Biosynthese, basiert, eine Alternative angesichts des oben genannten Problems. Unsere Oszillatoren können den Fluss der AcP-Produktions- und -verbrauchswege autonom ausgleichen, die intrazelluläre AcP-Homöostase aufrechterhalten (Abb. 6g und 7g) und eine übermäßige Proteinacetylierung vermeiden (Abb. 6h), was zu einer Erhöhung der Kohlenstoffausbeute in der Bioproduktion führt. Im Vergleich zu E. coli-Stämmen mit statisch rekonfiguriertem zentralen Stoffwechselnetzwerk verbesserte die Verwendung der AcP-zentrierten Oszillatoren die Produktion von 3HP, MVA und PHB bei der Kultivierung im Schüttelkolben um das 4,3-, 3,7- und 3,3-fache (Abb. 7d, i, j). Bei der Fed-Batch-Fermentation wurde 3HP auf bis zu 73,42 g/L mit einer Ausbeute von 0,51 g/g Glucose angereichert (Abb. 7f), was die höchste 3HP-Produktion und -Ausbeute darstellt, die über den Malonyl-CoA-Weg berichtet wurde.

Alle in dieser Studie verwendeten Plasmide und Stämme sind in den Zusatzdaten 2 bzw. 3 aufgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Primer und Sequenzen genetischer Teile sind in den Zusatzdaten 4 bzw. 5 aufgeführt. Für die Plasmidkonstruktion wurde der E. coli-Stamm DH5α verwendet. E. coli BL21(DE3) und Plasmid pET28a wurden zur Überexpression von FbaA, Xfspk und SBPasen aus sechs verschiedenen Stämmen verwendet, die weiter zur Proteinreinigung verwendet wurden. E. coli BW25113 wurde als Wirt für die SCTPK-Konstruktion, -Optimierung und -Anwendung verwendet. Zwei künstlich konstruierte Plasmide auf Basis von pETDuet-1 und pRSFDuet-1 wurden verwendet, um verwandte Enzyme im Produktsyntheseweg zu exprimieren. Insbesondere wurde pETD für die kombinatorische Expression von Xfspk- und asRNA-Arrays verwendet, während pRSF für die kombinatorische Expression von PTA und Enzymen stromabwärts des spezifischen Signalwegs verwendet wurde (MvaE und MvaS für Mevalonat53; AccADBC, MCR-N und MCR-C für 3HP7; PhaC, PhaA und PhaB für PHB54; Sequenzen siehe Supplementary Data 6). Alle für die Werkzeugentwicklung und -anwendung verwendeten Konstrukte wurden mithilfe des Standard-Restriktionsklonens mit Enzymen von Takara Bio (Dalian, China) oder des ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit-Verfahrens von Vazyme Biotech (Nanjing, China) generiert. Für die DNA-Extraktion wurden PCR-Reinigungs- und Miniprep-Kits (Omega, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers verwendet. Kompetente Zellen wurden mit dem Ultra-Competent Cell Preps Kit (Sangon Biotech, China) hergestellt. Primer wurden von einem kommerziellen Synthesedienstleister (Tsingke, China) gekauft. Alle konstruierten Plasmide wurden durch DNA-Sequenzierung (Tsingke, China) bestätigt.

Für die Konstruktion von SCTPK wurde die auf Stein-Schere-Papier basierende CRISPR/Cas9-Strategie verwendet, um das Chromosom zu bearbeiten, einschließlich der Löschung oder Ersetzung genetischer Sequenzen von Genen in E. coli55. Die Gene idhA, adhE, pflB, poxB, aceE, tktAB, talAB wurden ausgeschaltet. Die Gene zur Kodierung von SBPasen aus verschiedenen Stämmen (Bacillus methanolicus, Saccharomyces cerevisiae CEN.PK, Serratia marcescens, Synechocystis PCC 6803, Thermosynechococcus elongatus) und Xfspk aus Bifidobacterium longum NCC2705 wurden mit Codonoptimierung für E. coli (Supplementary Data 7) von BGI synthetisiert Biotechnologie und GenScript Biotech Corporation. Die SBPase aus Synechocystis PCC 6803 wurde mit einem konstitutiven Promotor Pj23119 und B0034 RBS über CRISPR/Cas9 in das Genom integriert. Alle Spacer wurden von sgRNAcas9 V3.056 entworfen. Die folgenden Konzentrationen an Antibiotika wurden verwendet: Spectinomycin 100 µg/ml, Apramycin 100 µg/ml, Chloramphenicol 33 µg/ml und Tetracyclin 17 µg/ml, Kanamycin 50 µg/ml und Ampicillin 100 µg/ml. Um die Gene pfkA, GapA und GapB zum Schweigen zu bringen, wurden verschiedene Promotoren (Pj23116, Pj23118, Pj23119) und Zielsequenzlängen (0, 50, 80, 100, 150, 200 nt) ausgewählt, um die Wirkung der asRNA-Repression zu überprüfen. asRNA-Arrays werden über Golden Gate zusammengestellt. Der mutierte glnAp2-Promotor, der verschiedene Enhancer oder Governors enthält, wurde durch die einstufige ortsspezifische Plasmidmutagenese hergestellt. Kurz gesagt, die Mutagenese wurde durch inverse PCR des Plasmids unter Verwendung der entsprechenden Primer erzeugt und das durch DpnI (New England Biolabs, USA) verdaute PCR-Produkt wurde in E. coli DH5α transformiert. Kolonien mit verwandten Mutationen wurden durch PCR verifiziert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Um einen negativen Rückkopplungskreis aufzubauen, wurde der durch den Promotor Pg induzierte PhlF-Repressor zusammen mit einem schwachen B0031-RBS über CRISPR/Cas9 in das Genom eingeführt.

Für die Konstruktion von Plasmiden und Stämmen wurde Luria-Bertani (LB)-Medium verwendet. Um zu testen, ob SCTPK in vivo funktionsfähig ist, wurden LB-Medium und modifiziertes M9-Minimalmedium verwendet, das 15,11 g/L Na2HPO4·12H2O, 3,0 g/L KH2PO4, 1,0 g/L NH4Cl, 0,5 g/L NaCl, 20 g/L enthält. L-Glukose, 1 g/L Hefeextrakt, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM FeCl3 und 10 ml Spurenelementlösung (0,18 g/L ZnSO4·7H2O, 0,12 g/L MnSO4·H2O, 0,18 g/L CoCl2·6H2O, 0,12 g/L CuCl2·2H2O).

Für die Produktion von MVA und PHB enthält das Fermentationsmedium 9,8 g/L K2HPO4·3H2O, 2,1 g/L Citrathydrat, 0,3 g/L Ammoniumeisencitrat, 0,25 g/L MgSO4·7H2O, 5 g/L Rindfleischextrakt, 2 % Glucose und 1 ml Spurenelementlösung (0,29 g/L ZnSO4·7H2O, 0,37 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,25 g/L CuSO4·5H2O, 1,58 g/L MnCl2·4H2O und 2,47 g/L H3BO4 ). Zur Herstellung von 3HP enthält das modifizierte Minimalmedium 14 g/L K2HPO4·3H2O, 5,2 g/L KH2PO4, 1 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 0,25 g/L MgSO4·7H2O, 5 g/L Hefeextrakt und 2 % Glukose. Experimente mit Schüttelkolben wurden dreifach in 250-ml-Kolben mit 50 ml Medium durchgeführt. Um den Einfluss von Rindfleischextrakt oder Hefeextrakt auf die Produktion der Zielchemikalien auszuschließen, wurden Kontrollexperimente mit dem oben genannten Medium ohne Glucose durchgeführt. Die Produktion von 3HP, MVA und PHB lag unter 80 mg/L (ergänzende Abbildung 27), was darauf hindeutet, dass Rindfleischextrakt oder Hefeextrakt nur eine wachstumsfördernde Wirkung hatten, aber nicht zur Herstellung von Zielchemikalien verwendet werden können. Daher wurde die Ausbeute der Zielchemikalie wie folgt berechnet:

Die Fermentation wurde in einem 5-l-Bioreaktor mit 2 l Medium durchgeführt. Die Kulturtemperatur wurde auf 37 °C kontrolliert, der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten, der gelöste Sauerstoff (DO) wurde durch Kaskadenbewegung (400–700 U/min) über 40 % Sättigung gehalten und es war kein chemischer Induktor erforderlich. Nachdem die anfänglichen Kohlenstoffquellen nahezu erschöpft waren, wurde mit dem Fed-Batch-Modus begonnen, indem eine Lösung mit 50 % (Gew./Vol.) Glucose zugeführt wurde. Bei Bedarf wurden Proben entnommen und analysiert.

Das Zellwachstum wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) der Kultur bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (U-2900; Hitachi) untersucht. Die Restglukosekonzentration wurde mit einem biologischen Sensoranalysator SBA-40ES (Institut für Biologie, Shandong Academy of Sciences, China) erfasst. Pyruvat, Acetat, Laktat, MVA, 3HP wurden unter Verwendung eines HPLC-Systems der Serie Agilent 1260 Infinity, ausgestattet mit einer HPX-87H-Säule (Bio-Rad, Hercules, CA) (300 × 7,8 mm) bei 40 °C mit 5 mmol/l bestimmt Schwefelsäure als mobile Phase. Alle Kulturproben wurden 10 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert und dann vor der Analyse durch einen 0,22-μm-Filter filtriert.

Um den AcP-Gehalt zu bestimmen, wurden einzelne Kolonien, die die entsprechenden Plasmide enthielten, über Nacht in LB-Medium bei 37 °C gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in frischem M9-Medium mit 2 % Glucose bei einer anfänglichen OD600 von 0,02 resuspendiert und bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet. Beim Erreichen der stationären Phase wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM, pH 7,2–7,4) gewaschen und mit einem Hochdruck-Zellaufschlussgerät (Constant Systems LTD, UK) aufgeschlossen. Der AcP-Assay wurde mit geringfügigen Änderungen aus einer früheren Studie abgeleitet12,47. Konkret wurden 500 μl Probe zu 250 μl Hydroxylamin-Reagens (4 M Hydroxylaminhydrochlorid: 3,5 M Natriumhydroxid = 1:1, Vol./Vol.) gegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, um Hydroxamat zu bilden. Dann wurde das Färbemittel, 750 μl Eisenchloridlösung (5 % Eisenchlorid: 12 % Trichloressigsäure: 3 M HCl = 1:1:1, Vol./Vol./Vol.), zugegeben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten Die Absorption bei 540 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Spark, Tecan) gemessen. PHB wurde mit zuvor beschriebenen Methoden mit geringfügigen Modifikationen gemessen57. Kurz gesagt, die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 ° C von der Fermentationsbrühe getrennt. Zellpellets wurden zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert, 3 Stunden lang mit 20 Milliliter 0,05 M NaOH-Lösung behandelt und dann 20 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem Ethanol (95 %, Analysequalität) gewaschen und zur weiteren Analyse einer Gefriertrocknung unterzogen.

Um die Freisetzung von CO2 zu erkennen, wurde ein Gasanalysesystem (BCP-CO2, BlueSens, Deutschland) verwendet, um die Echtzeitänderungen von CO2 im Schüttelkolben während der Inkubation in situ aufzuzeichnen und zu analysieren. Die Kulturen wurden bei 37 °C unter Schütteln mit 180 U/min gezüchtet. Der Detektor überwacht alle 1 Minute das CO2-Volumen und übermittelt die Informationen an einen Computer.

Die E. coli-Zellen wurden gesammelt und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,01 M, pH 7,2–7,4) gewaschen und mit einem Hochdruck-Zellaufschlussgerät (Constant Systems LTD, UK) aufgeschlossen. Das his6-markierte rekombinante Protein wurde unter Verwendung einer Ni-NTA-His·Bind-Säule (Novagen) gereinigt. Das Protein wurde mit einem Bradford-Protein-Assay-Kit (Beyotime, China) quantifiziert, auf einem 12 %igen SDS-PAGE-Gel fraktioniert und durch Coomassie-Blau-Färbung sichtbar gemacht. Für den Western Blot wurden die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen und mit einem Schnellblock-Westernreagenz (Beyotime, China) blockiert. HRP Anti-6X His-Tag-Antikörper [GT359] (Abcam, Katalog-Nr. ab184607, 1:10.000) wurde zum Nachweis von His6-markierten Proteinen und monoklonaler Acetyl-Lysin-Maus-Antikörper (EasyBio, China, Katalog-Nr. BE3411, 1:2000) verwendet ) und Ziegen-Anti-Maus-IgG (H&L)-HRP-konjugierter Antikörper (EasyBio, China, Katalog-Nr. BE0102, 1:10.000) wurden für die Proteinacetylierungsanalyse verwendet. Anschließend wurde das Proteinsignal mit dem Immobilon Western HRP-Substrat (Millipore) und dem Fusion FX6 Imaging System (Vilber, Frankreich) nachgewiesen.

Das gereinigte Protein wurde unter Verwendung einer NAP-10-Säule (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, USA) entsalzt. Die SBP/FBPase-Aktivität wurde wie folgt bestimmt58: Das Reaktionsgemisch, das 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 15 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 mM E4P, 10 mM DHAP und gereinigtes FbaA und SBP/FBPase enthielt, wurde bei 37 °C inkubiert 30 Minuten lang gerührt und die Reaktion durch Zugabe von 0,2 M Perchlorsäure gestoppt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand einer Phosphatquantifizierung unterzogen. Aliquots (20 μl) der Probe und Standards (0–0,5 mM KH2PO4) wurden mit 340 μl Molybdatlösung (0,3 % Ammoniummolybdat in 0,55 M H2SO4) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Sechzig Mikroliter Malachitgrünlösung (0,035 % Malachitgrün, 0,35 % Polyvinylalkohol) wurden zugegeben und die Proben weitere 45 Minuten lang inkubiert. Die Absorption bei 620 nm wurde mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Spark, Tecan) bestimmt. Die durch Phosphoketolase katalysierte Reaktion fand 30 Minuten lang in Puffer statt, der 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 15 mM MgCl2, 10 mM DTT, 5 mM KCl, 20 mM Kaliumphosphat, 1 mM Thiaminpyrophosphat, 0,25 μM Phosphoketolase und 10 enthielt mM Substrat. Für die S7P-Phosphoketolase-Aktivität wurden 10 mM DHAP und E4P mit 0,25 μM FbaA und SBPase ergänzt. Für die F6P- und X5P-Phosphoketolase-Aktivität wurden 10 mM F6P bzw. X5P verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl Hydroxylaminreagenz gestoppt. Anschließend wurde die AcP-Konzentration gemessen.

Um das Zellwachstum und die Fluoreszenzintensität zu testen, wurden die entsprechenden Daten auf einem Multimode-Mikroplattenlesegerät (Spark, Tecan) unter Verwendung von 96-Well-Schwarzplatten aufgezeichnet. Die mTagBFP2-Intensität wurde bei einer Anregungswellenlänge (EX) von 402 ± 5 nm und einer Emissionswellenlänge (EM) von 457 ± 10 nm gemessen, die GFP-Intensität wurde bei einer EX von 480 ± 5 nm und einer EM von 520 ± 10 gemessen nm, und die mCherry-Intensität wurde bei einem EX von 588 ± 10 nm und einem EM von 645 ± 10 nm gemessen. Die Hintergrundfluoreszenz des Stammes ohne fluoreszierende Proteinexpression (FLbg) und die Hintergrund-OD des Mediums (ODbg) wurden gemessen und die relativen Fluoreszenzintensitäten wurden wie folgt berechnet:

Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde das Laser Scanning Confocal Microscope LSM900 (ZEISS, Deutschland) verwendet, und Fiji (NIH) wurde zum Zusammenführen der Bilder der Kanäle verwendet. Um räumliche Muster zu erkennen, wurde der Stamm Q4602 auf einer LB-Agarplatte verteilt, eine sterilisierte Filterpapierscheibe in die Mitte der Platte gelegt und AcP-Lösung auf die Scheibe aufgetragen. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37 °C wurde die Fluoreszenz mit einem LED-Transilluminator (BL-20, LABGIC) sichtbar gemacht.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem EASYSpin Plus Bacterial RNA-Kit (Aidlab Biotechnologies, China) isoliert und mit einem Nanodrop oneC-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Genomische DNA wurde entfernt und cDNA wurde unter Verwendung des Evo M-MLV RT Kit mit gDNA Clean für qPRC II (Accurate Biology, China) erhalten. Die quantitative PCR wurde mit dem SYBR Green Pro Taq HS qPCR Kit (Accurate Biology, China) mit dem QuantStudio 1-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Das konstitutiv transkribierte Gen rpoD wurde als Referenzkontrolle verwendet, um die Gesamt-RNA-Menge verschiedener Proben zu normalisieren. Die relative Menge des mRNA-Spiegels wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Es wurden drei unabhängige biologische Proben mit zwei technischen Wiederholungen für jede Probe durchgeführt.

Die Software für die anfängliche Datenverarbeitung war Microsoft Excel 2019, und nachfolgende Analysen und Darstellungen wurden mit OriginPro 2022 (OriginLab) und Graphpad Prism 9 (Graphpad) durchgeführt. Die Spacer der gRNA wurden von sgRNAcas9 v3.0 entworfen. Die Fluoreszenzintensitäten wurden mit Magellan 3.0 (Tecan) bestimmt. Die Bilddaten wurden von Zen 3.3 (Zeiss) und Fiji (NIH) erfasst und verarbeitet. Die relevanten Kurven wurden mit OriginPro 2022 (OriginLab) angepasst. Zur Berechnung der spezifischen Wachstumsrate wurde das Logistikmodell verwendet. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige Student-T-Tests durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die folgenden Informationen wurden in den Ergänzungsdatendateien bereitgestellt: die in dieser Studie verwendeten Plasmide (Ergänzungsdaten 2), Stämme (Ergänzungsdaten 3), Primer (Ergänzungsdaten 4), die Sequenzen von Promotoren, Gouverneuren, Enhancern, Terminatoren, Linkerpeptiden und Gene, die in AcP-empfindlichen genetischen Schaltkreisen und in der Biosynthese verwendet werden (Ergänzungsdaten 5 und 6), Sequenzen und Zugangsnummern von SBPasen (Ergänzungsdaten 7). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Studie wurde finanziell unterstützt vom National Key Research and Development Program of China (2022YFC2104700 und 2021YFC2100500 bis GZ), NSFC (22277068 bis ML, 32170085 bis GZ), den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2021JCG025 bis GZ) und dem Distinguished Scholars Program der Shandong University (GZ) und Stiftung für innovative Forschungsgruppen des State Key Laboratory of Microbial Technology (WZCX2021-02).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Likun Guo, Min Liu.

Staatliches Schlüssellabor für mikrobielle Technologie, Shandong-Universität, Qingdao, 266237, China

Likun Guo, Min Liu, Yujia Bi, Qingsheng Qi und Guang Zhao

CAS Key Lab of Biobased Materials, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Qingdao, 266101, China

Mo Xian & Guang Zhao

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GZ und LG haben die Experimente entworfen. LG, ML und YB führten die Experimente durch. GZ, LG, ML, QQ und MX analysierten die Ergebnisse. GZ, LG und ML haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript vor der Einreichung bearbeitet.

Korrespondenz mit Guang Zhao.

Diese Arbeit wurde in chinesische Patentanmeldungen der Shandong-Universität aufgenommen (Anmeldenr. 2023107236122 und 2023107489681). Zu den Mitautoren des Patents gehören GZ, LG, ML, YB und Jichao Wang. Das Patent umfasst die Konstruktion und Optimierung des Kohlenstoffkonservierungswegs SCTPK, den Entwurf und die Charakterisierung genetischer Schaltkreise zur Aktivierung und Hemmung von Acetylphosphat, die Einrichtung eines zentralen Oszillationssystems für Acetylphosphat und die Anwendung des Acetylphosphat-Oszillationssystems bei der Biosynthese von Chemikalien und Materialien. Andere Autoren behaupten keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Guo, L., Liu, M., Bi, Y. et al. Verwendung einer synthetischen Maschinerie zur Verbesserung der Kohlenstoffausbeute mit Acetylphosphat als Kern. Nat Commun 14, 5286 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41135-7

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Eingegangen: 15. Mai 2023

Angenommen: 23. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41135-7

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